Drug-induced Sensibilisering av adenylyl cyclase: Analyse Effektivisering og miniatyrisering for lite molekyl og siRNA screening programmer
Summary
Vedvarende aktivering av hemmende G protein-koblede reseptorer resulterer i sensibilisering av adenylyl cyclase signalering. For å identifisere de essensielle molekylære veier, nonbiased tilnærminger er nødvendig, men denne strategi krever utviklingen av en skalerbar cellebasert assay cAMP sensibilisering. Heri, beskriver vi en allergi analysen for lite molekyl og siRNA screening.
Abstract
Sensibilisering av adenylat cyclase (AC) signalisering har vært innblandet i en rekke nevropsykiatriske og nevrologiske forstyrrelser, inkludert stoffmisbruk og Parkinsons sykdom. Akutt aktivering av Gαi / o-koblede reseptorer hemmer AC-aktivitet, mens det vedvarende aktivering av disse reseptorene resulterer i en heterolog sensibilisering av AC og økte nivåer av intracellulært cAMP. Tidligere studier har vist at denne forbedring av strømrespons observert både in vitro og in vivo som følge av kronisk aktivering av flere typer Gαi / o-koblede reseptorer, inkludert D 2 dopamin og μ opioidreseptorer. Selv heterologe sensibilisering av AC først ble rapportert fire tiår siden, mekanismen (e) som ligger til grunn for dette fenomenet fortsatt i stor grad ukjent. Mangelen på mekanistiske data gjenspeiler antagelig kompleksiteten involvert med denne adaptiv respons, noe som tyder på at nonbiased tilnærminger kunne hjelpe til med å identifisereing de molekylære stier involvert i heterologe sensibilisering av AC. Tidligere studier har antydet kinase og Gbγ signale som overlappende komponenter som regulerer heterologe sensibilisering av AC. Å identifisere unike og flere overlappende mål knyttet til sensibilisering av AC, er utvikling og validering av en skalerbar cAMP allergi analysen som kreves for større gjennomstrømming. Tidligere fremgangsmåter for å studere sensibilisering er generelt tungvint involverer kontinuerlig cellekultur vedlikehold, så vel som en kompleks metode for måling av cAMP akkumulering som involverer flere vasketrinn. Dermed vil utviklingen av en robust cellebasert assay som kan brukes for high throughput screening (HTS) i en 384 brønns lette fremtidige studier. Ved hjelp av to D 2 dopamin reseptor cellulære modeller (dvs.. CHO-D 2L og HEK-AC6 / D 2L), har vi konvertert vår 48-vel allergi analysen (> 20 trinn 4-5 dager) til en fem-step, eneste dag analysen i 384-brønnen format. Denne nye formatet er mottagelig for lite molekyl screening, og vi vise at dette assay utforming også kan lett anvendes for omvendt transfeksjon av siRNA i påvente av målrettet siRNA-bibliotek-screening.
Introduction
En adaptiv adenylyl cyclase (AC) signal respons kjent som heterologe-eller super-allergi ble først oppdaget i laboratoriet av nobelprisvinner, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg foreslått at den observerte økning strømrespons etter kronisk δ opioid reseptor aktivering var en mekanisme som er involvert i opiat toleranse og avhengighet 1.. I tillegg til kronisk δ opioid reseptor aktivering, denne neuroadaptive respons på strømsignalisering skjer også etter vedvarende aktivering av flere andre Gαi / o-coupled receptors to. Særlig er mange av disse reseptorene er assosiert med smerte, nevropsykiatriske og nevrologiske lidelser, og omfatter μ / κ opioid, D 2/4 dopamin, 5HT 1A, og M 2/4 muskarinreseptorer 2. I tillegg til Dr. Nirenberg funn, eksisterer en stor mengde bevis knytter sensibilisering av AC signale til kronisk opioid reseptor aktivering både <em> in vitro og in vivo 3-7. Sensibilisering av AC har også vært forbundet med en rekke sykdommer som involverer D-2-lignende dopaminreseptorer inkludert schizofreni og Parkinsons sykdom (for gjennomgang se referanse 2). Til tross for den potensielle betydningen av allergi, den nøyaktige mekanismen (er) forbundet med vedvarende Gαi / o-koblet reseptor aktivering som fører til økt AC respons fortsatt i stor grad ukjent.
Disse studiene gir begrunnelsen for å undersøke mekanismene for sensibilisering av adenylyl cyclase som en viktig nevrobiologisk mål. Likeledes bør den fysiologiske relevans av strømsignalisering 8 og den betydning at de enkelte veksel isoformer holder i denne adaptive også anerkjennes 2,9,10. I sammenheng med vår forskning, de generelle funksjoner knyttet til heterologe sensibilisering av rekombinante isoformer av AC parallelt disse egenskapene desbert for å studere de endogene isoformer av AC. Konkret har tidligere forskning funnet at aktiveringen av Gαi / o proteiner og påfølgende utslipp / omorganisering βγ subenheter er viktige krav reseptor indusert sensibilisering av alle AC isoformer. I tillegg viste flere studier tyder på at signale fra protein kinaser og Gβγ subenheter er involvert i allergi 2,11-13. Individuelle ACs også vise unike og distinkte allergi mønstre 12. For eksempel er vedvarende eksponering av D-2 reseptorene til agonister forbundet med sensibilisering av AC1 og AC8 i Ca2 + / kalmodulin stimulering 14,15, mens den tilgrensende AC3 ikke er sensibilisert 2.. AC2, AC4, og AC7 er nært beslektet, men er bare PKC-stimulert AC2 aktivitet robust sensibilisert etter langvarig eksponering av D 2 reseptorer å agonister 7,14,16,17. I tillegg AC5 og AC6 viser en markert grad av Heterologous sensibilisering til Gas-og forskolin-stimulert cAMP akkumulering etter aktivering av D 2 reseptorer 14,18-20, men ser ut til å variere i deres krav om Gβγ subenhet-AC interaksjoner 21. Selv om de fleste studier av AC sensibilisering har brukt modellcellelinjer (f.eks HEK293 celler uttrykker individuelle AC isoformer), ser det ut til at disse funnene kan overføres til innfødte nevronale cellemodeller 4,22. Flere nylig, kan effekten av AC isoformselektive selektive lite molekyl hemmere identifisert i HEK293 celler uttrykker AC isoformer også bli oversatt til in vivo atferdsstudier 23.
Mangelen på en identifisert molekylmekanisme for heterolog sensibilisering sannsynlig reflekterer kompleksiteten til det adaptive, så vel som de unike regulatoriske egenskaper av individuelle AC isoformene 12. Rakne slik kompleksitet er ytterligere komplisert ved bruk av tungvinte metoden thatten har begrenset akademiske etterforskere fra ansette objektive tilnærminger. For eksempel våre tidligere mekanistiske undersøkelser omfattet bruk av kontinuerlig dyrkede cellemodeller ved bruk av 24 – og 48-brønners vevskultur-format 15. Dyrkede celler ble vanligvis dyrket i 48 timer og deretter utsatt for agonist behandling (2-18 timer), etterfulgt av en serie av celle vasker og inkubasjoner (figur 1). AC-isoformselektive spesifikke cAMP akkumulering protokoller ble deretter ansatt fulgt av måling av cAMP akkumulering ved en omstendelig og tidkrevende [3 H] cAMP bindende metodikk 15,24. Varigheten fra start til slutt for hver analyse vanligvis kreves i alt fire til fem dager fra celle plette til data-analyse (figur 1). Anvendelsen av ny teknologi og automatisering har ført til markerte forbedringer for overfølsomhets studier i det industrielle og HTS senteret innstilling. For eksempel, en gruppe som jobber med Nasjonalt Senter for Chemical Genomics rapportert en todagers HTS analyseprosedyre for å identifisere små molekyl hemmere av μ opioidreseptor indusert sensibilisering i 1536-brønnformat 25.
Denne artikkelen beskriver arbeidet med å utvikle en HTS-analysen for studier av heterolog allergi ved hjelp av teknologier som er tilgjengelig på de fleste akademiske forskningsinstitusjoner. Denne strategien ble oppnådd ved å innarbeide bruken av cryopreserved celler fra cellemodeller, heterologt uttrykte D 2 dopamin-reseptoren i kombinasjon med endogene eller individuelle rekombinante adenylat cyclase-isoformene (CHO-D 2L eller HEK-AC6 / D 2 L). For å forbedre vår gjennomstrømning, redesignet vi vår 48 godt allergi analysen (ca.> 20 trinn mer enn 4-5 dager) til en fem-trinns, eneste dag analysen i 384-brønnen format som i hovedsak var "mix og lese". Det nye formatet bruker en kommersielt tilgjengelig homogen tid løst fluorescens (HTRF) analyse for å måle cAMP accumulation i intakte celler med en multi-modus plateleser. Analysen er robust og mottagelig for lite molekyl screening, og kan effektivt anvendes for å screene for hemmere av heterolog sensibilisering. I tillegg gir vi data som tillater bruk av denne analysen med omvendt transfeksjon av siRNA for målrettet eller genom bred siRNA-bibliotek screening med bare en mindre modifikasjon av den generelle metode.
Protocol
Representative Results
Discussion
I et forsøk på å legge til rette for studier av heterolog allergi, har vi i stor utstrekning endret vår forrige metoden oppnå en strømlinjeformet "mix og lese" format som er amendable til high-throughput screening og virkningsmekanisme eksamen. De store modifikasjoner på vår protokoll kan oppsummeres som følger: 1) bruk av cryopreserved celler som "analyse-ready" reagenser, 2) miniatyrisering av analysen i 384-brønnformat, og 3) bruk av den HTRF måling cAMP.
Fa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Mr. Richard Zink og Todd Wiernicki for metodisk trening og analysen veiledning. Vi takker også John Paul Spence for grundig lesning og redaksjonelle forslag. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, og Eli Lilly and Company gjennom Lilly Research Award Program (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referências
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
