Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.
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Artigo de método
Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications
Neste artigo
Resumo
Resumo
Sensibilização de adenilil-ciclase (AC) de sinalização tem sido implicada numa variedade de distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, incluindo o abuso de substâncias e na doença de Parkinson. Activação aguda de Gαi / O-ligada receptores inibe a actividade de AC, enquanto que a activação persistente de estes receptores resulta na sensibilização heteróloga de CA e um aumento dos níveis de AMPc intracelular. Estudos anteriores demonstraram que esta melhoria da capacidade de resposta de CA é observada tanto in vitro e in vivo a seguir a activação crónica de vários tipos de receptores Gαi / ligada a O, incluindo D 2 da dopamina e μ receptores opióides. Apesar de sensibilização heteróloga do AC foi relatada pela primeira vez há quatro décadas, o mecanismo (s) que estão na base deste fenômeno são ainda desconhecidas. A falta de dados mecanicistas presumivelmente reflete a complexidade envolvida com esta resposta adaptativa, o que sugere que as abordagens nonbiased poderia ajudar na identificaçãoção das vias moleculares envolvidas na sensibilização heteróloga do AC. Estudos anteriores têm implicado quinase e sinalização Gbγ como sobreposição de componentes que regulam a sensibilização heteróloga do AC. Para identificar alvos sobrepostos únicos e adicionais associados com a sensibilização da AC, o desenvolvimento ea validação de um ensaio de sensibilização cAMP escalável é necessário para uma maior taxa de transferência. As abordagens anteriores para estudar sensibilização são geralmente complicado que implica a manutenção de cultura de células contínuo, bem como uma complexa metodologia para medição da acumulação de AMPc que envolve vários passos de lavagem. Assim, o desenvolvimento de um ensaio de base celular robusto, que pode ser utilizado para rastreio de alto rendimento (HTS) em um formato de 384 poços iria facilitar estudos futuros. Usando dois modelos celulares D 2 receptores de dopamina (ie. CHO-D 2D e HEK-AC6 / D 2D), convertemos o nosso ensaio de sensibilização 48 poços (> 20 passos 4-5 dias) para um período de cinco step, ensaio dia único em formato de 384 poços. Este novo formato é passível de triagem pequena molécula, e que demonstram que este desenho do ensaio também pode ser facilmente utilizado para a transfecção reversa de siRNA em antecipação de rastreio da biblioteca de siRNA alvo.
Introdução
Um adenililciclase adaptativo (AC) de sinalização de resposta conhecida como a sensibilização de super-heteróloga ou foi descoberto pela primeira vez no laboratório do Prêmio Nobel, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg proposto que o aumento da capacidade de resposta AC observado após a ativação do receptor opióide δ crônica era um mecanismo envolvido na tolerância e dependência de opiáceos 1. Além disso a activação do receptor opióide δ crónica, esta resposta neuroadaptativo de sinalização AC também ocorre a seguir a activação persistente de vários outros Gαi / acoplada-o-receptores 2. Notavelmente, muitos destes receptores estão associados co....
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Protocolo
1. Expansão e criopreservação de células Ensaio Pronto
- Cultura de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) sobre uma cultura de células prato 15 centímetros 2 em meio F12 de Ham enriquecido com 1,0 uM de L-glutamina, 800 ug / mL de G418, 300 ug / higromicina ul, 100 U / ul penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, e 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Incubar as células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 até as células são 90-95% confluentes. Lavar as células com 10 uL de Tampão Fosfato Salino (PBS), e colher as células por adição de 3 ul de tampão de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C.....
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Resultados
Parte I. Desenvolvimento de um ensaio de sensibilização bem heterólogo 384 para a identificação de inibidores de moléculas pequenas utilizando um modelo de células comercialmente disponível.
Estudar sensibilização heteróloga em um modelo de celular, fizemos uma série de melhorias que nos permitiu agilizar o ensaio em um formato "misturar e ler". Várias das modificações principais são destacadas a seguir, e são descritos em mais pormenor na discussão. O primeiro pas.......
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Discussão
Em um esforço para facilitar os estudos de sensibilização heteróloga, temos extensivamente modificado nosso método anterior alcançar uma simplificada "mix e ler" formato que pode ser alterada a seleção de alto rendimento e mecanismo de exame ação. As modificações importantes nosso protocolo pode ser resumido como se segue: 1) o uso de células criopreservadas como reagentes de ensaio "pronto", 2) a miniaturização do ensaio em formato de 384 poços, e 3) a utilização da medição de HTRF cAMP.
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o Sr. Richard Zink e Todd Wiernicki para treinamento e orientação metodológica ensaio. Agradecemos também a John Paul Spence para a leitura cuidadosa e sugestões editoriais. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company por meio do Programa de Pesquisa Prêmio Lilly (LRAP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células CHO-K1-DRD2L | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham' s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies | 15070063 | |
| pratos de 15 cm | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Tampão de dissociação celular | Life Technologies | 13150016 | |
| tampão fosfato Salino | Fisher | ||
| 976171 | |||
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC tratadas com placas de 384 poços | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapina | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-) Sulpirida | Sigma | S112 | |
| Lipofectamina 2000 reagente de transfecção | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan azul | Vida Tecnologias | T10282 | |
| livre de água, DNase e RNase | Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA siRNA | personalizado | ||
| Dharmacon Controle de siRNA não direcionado | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referências
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by....
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Reimpressões e permissões
