من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.
الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية مصنوعة من الحمض النووي والبروتينات التي تتحكم في العمليات التي تعتمد على الحمض النووي المختلفة. وينظم هيكل لونين وظيفة في مناطق معينة من التخصيب المحلي للهيستون بعد متعدية التعديلات (hPTMs) والمتغيرات، والبروتينات ملزمة لونين، بما في ذلك عوامل النسخ، والحامض النووي. توصيف البروتين من تكوين لونين في مناطق وظيفية متميزة أعاق حتى الآن بسبب عدم وجود بروتوكولات فعالة لإثراء هذه المجالات في النقاء وكمية مناسبة لاحقة لتحليل متعمق من قبل الطيف الكتلي (MS). نحن هنا وصف استراتيجية البروتينات لونين المصممة حديثا، واسمه ChroP (CHRO ماتان P roteomics)، حيث تم استخدام لونين مناعي التحضيرية لعزل المناطق التي لونين متميزة الميزات، من حيث hPTMs، وشارك المتغيرات المرتبطة البروتينات غير histonic، هي تحليلها من قبل MS. نحن لتوضيح انهإعادة المنطقة لاقامة ChroP لإثراء وتحليل المناطق heterochromatic الصمت transcriptionally، والتي تمثلت في وجود ثلاثي مثيلة ليسين 9 على هيستون H3. النتائج التي تحققت بيان إمكانيات ChroP في وصف بدقة بروتيوم المغاير واثبات ذلك باعتبارها استراتيجية تحليلية قوية لفهم كيفية محددات البروتين متميزة من لونين تفاعل وتضافر لإنشاء تكوينات الهيكلية والوظيفية مكان محدد.
الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية التي تشارك كقالب الأساسي لكافة العمليات بوساطة الحمض النووي. النيوكليوسومات هي الوحدة الأساسية المتكررة من لونين وتتكون من نواة octameric البروتينية التي تحتوي على جزيئين من كل H2A هيستون الكنسي، H2B، H3 H4 و، وتجمع حولها 147 سنة مضت من الحمض النووي يتم تغليف 1،2. وتنظم كل histones الأساسية كمجال كروي ومرنة N-محطة "ذيل" أن يبرز خارج جسيم نووي. ويستند إحدى الآليات الرئيسية لتنظيم بنية الكروماتين وديناميكية على التساهمية التعديلات بعد متعدية (PTMs)، والتي تحدث أساسا على N-تيرميني من الهستونات 3،4. يمكن التعديلات هيستون تعمل إما عن طريق تغيير بنية النظام أعلى لونين، من خلال تغيير الاتصالات بين الهستونات-DNA أو بين Nucleosomes لل، وبالتالي السيطرة على إمكانية الحصول على البروتينات ملزمة الحمض النووي (آليات رابطة الدول المستقلة)، أو عن طريق العمل كمركز dockinز مواقع للبروتينات التنظيمية، إما وحدة واحدة، أو جزءا لا يتجزأ من المجمعات multimeric. ويمكن لهذه البروتينات التي تنظم ممارسة وظيفتها في طرق مختلفة: عن طريق تحوير مباشرة التعبير الجيني (أي البروتينات TAF)، أو عن طريق تغيير وضع النيوكليوسومات (أي لونين إعادة عرض المجمعات) أو عن طريق تعديل بقايا هيستون الأخرى (أي البروتينات مع ميثيل ترانسفيراز أو أسيتيل النشاط ترانسفيراز) (الآليات العابرة) 5. ملاحظة أن أنماط متميزة PTM العنقودية في مواضع محددة لونين أدى إلى وضع فرضية أن تعديلات مختلفة في مواقع متميزة قد تضافر لتوليد رمز الجزيئية التوسط في حالة وظيفية من الحمض النووي الأساسي. اكتسب "فرضية كود هيستون" توافق كبير في السنوات ولكن تم التحقق التجريبي الذي عقد قبل الظهر القيود التقنية 6،7.
وقد برزت البروتيوميات مطياف الكتلة (MS) على النحو الوارد فيأداة قوية لرسم أنماط تعديل هيستون وتميز ملزم لونين البروتينات 8. MS بالكشف عن التعديل باعتباره Δmass محددة بين كتلة التجريبية والنظرية من الببتيد. على مستوى الهستونات الفردية، MS يوفر وسيلة غير متحيزة وشاملة لخريطة PTMs، والسماح للكشف عن تعديلات جديدة وinterplays كاشفة بينهم 9-14.
في السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الاستراتيجيات لتشريح تكوين البروتين لونين، بما في ذلك توصيف الكروموسومات سليمة الإنقسامية 15، وتحديد للذوبان في ملزمة hPTM البروتينات 16-18 وعزل وتحليل مناطق محددة لونين (أي التيلوميرات) 19،20. ومع ذلك، والتحقيق في أوجه التآزر موضع محددة بين PTMs هيستون، المتغيرات، والبروتينات المرتبطة ونين لا تزال غير مكتملة. هنا، نحن تصف نهجا جديدا، واسمه ChroP (الاستشراب roteomics ماتان P) 21، وأننا قد وضعت لتميز بكفاءة متميزة وظيفيا المجالات لونين. هذا النهج يتكيف مناعي لونين (رقاقة)، وبروتوكول راسخة المستخدمة في البحوث جينية، لتحليل البروتين كفاءة يستند إلى MS-من العينة المخصب. وضعنا اثنين من بروتوكولات مختلفة، اعتمادا على نوع من لونين تستخدم كمدخل ومسألة تتناولها MS؛ على وجه الخصوص: يعمل 1) الشذرة من لونين الأم غير المثبتة يتفاعل مع MNase لتنقية أحادية Nucleosomes للوتشريح hPTMs شارك في ربط (N-ChroP)؛ 2) يستخدم الشذرة من لونين crosslinked مجزأة بواسطة صوتنة في تركيبة مع استراتيجية interactomics القائم على SILAC لتوصيف جميع المشاركين في إثراء البروتينات لونين (X-ChroP) ملزمة. نحن هنا توضيح مزيج من N-X-وChroP لإثراء ودراسة المغاير، وذلك باستخدام H3K9me3 كطعم للخطوات مناعي. استخدام ChroP يمكن تمديدهاإما لدراسة مناطق مختلفة على لونين، أو تغييرات في تركيبة لونين داخل المنطقة نفسها خلال الفترة الانتقالية إلى حالة وظيفية مختلفة، مما يمهد الطريق لتطبيقات مختلفة في علم التخلق.
وصفناها مؤخرا ChroP، استراتيجية الكمية لتوصيف نطاق واسع من مكونات البروتين لونين. ChroP يجمع بين نهجين متكاملين المستخدمة في مجال جينية، والشذرة MS، والاستفادة من نقاط القوة والتغلب على القيود الخاصة بها. الشذرة جانب لتسلسل عميق (رقاقة تسلسل) يسمح للرسم خرائط الجينوم واس?…
The authors have nothing to disclose.
وقد نشر هذا البحث في الأصل في مول البروتيوميات الخلية. Soldi M. وBonaldi T. والبروتيومية التحقيق في لونين المجالات الوظيفية يكشف رواية Synergisms بين مكونات متميزة المغاير MCP. عام 2013؛ 12: 64-80. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. نشكر روبرتا Noberini (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا ومكتب التقييم المستقل، إيطاليا) لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم عمل السل من المنح المقدمة من جامعة هارفارد، Armenise برنامج جيوفاني مؤسسة التطوير الوظيفي، والجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان ووزارة الصحة الإيطالية. وأيد العمل MS بواسطة زمالة FIRC.
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |