De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin
Summary
Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.
Abstract
Chromatine is een zeer dynamische nucleoproteïne complex van DNA en eiwitten die verschillende DNA-afhankelijke processen regelt. Chromatinestructuur en functie op specifieke gebieden wordt geregeld door de plaatselijke verrijking van histon post-translationele modificaties (hPTMs) en varianten, chromatine-bindende eiwitten, waaronder transcriptiefactoren en DNA methylatie. De proteomics karakterisering van chromatine samenstelling op verschillende functionele gebieden tot dusver is gehinderd door het ontbreken van efficiënte protocollen om dergelijke domeinen te verrijken op de juiste zuiverheid en voor de daaropvolgende diepgaande analyse door massaspectrometrie (MS). We beschrijven hier een nieuw ontworpen chromatine proteomics strategie, genaamd ChroP (Chro matin P roteomics), waarbij een preparatieve chromatine immunoprecipitatie wordt gebruikt om verschillende chromatine gebieden waarvan de kenmerken qua hPTMs, varianten en co-geassocieerde derde histonic eiwitten te isoleren, zijn door MS geanalyseerd. We illustreren hijre het opzetten van ChroP voor de verrijking en analyse van transcriptioneel stille heterochromatic regio, gekenmerkt door de aanwezigheid van tri-methylatie van lysine 9 op histon H3. De behaalde resultaten tonen het potentieel van ChroP in grondig karakteriseren van de heterochromatin proteoom en bewijzen dat het als een krachtige analytische strategie om te begrijpen hoe de verschillende eiwit determinanten van chromatine interactie en synergie te locus-specifieke structurele en functionele configuraties vast te stellen.
Introduction
Chromatine is een zeer dynamische nucleoproteïne complex dat betrokken als primaire template voor DNA-gemedieerde processen. Het nucleosoom is de basis herhaalde eenheid van chromatine en bestaat uit een eiwitachtig octamère kern met twee moleculen van elk canonieke histon H2A, H2B, H3 en H4, waaromheen 147 bp DNA verpakt 1,2. Alle kernhistonen zijn gestructureerd als een bolvormige domein en een flexibele N-terminale "staart" die buiten de nucleosome uitsteekt. Een van de belangrijkste mechanismen voor het reguleren chromatinestructuur en dynamica is gebaseerd op covalente post-translationele modificaties (PTMs), die voornamelijk voor de N-termini van histonen 3,4. Histon modificaties kunnen functioneren hetzij door wijziging van de hogere orde chromatinestructuur door verandering contacten tussen histon-DNA of tussen nucleosomen en daarmee de toegankelijkheid van DNA-bindende eiwitten (cis mechanismen) regelen, of door als Docking sites voor regulerende eiwitten, hetzij als afzonderlijke eenheden, of ingebed in multimere complexen. Dergelijke regulerende eiwitten hun functie in verschillende manieren: door direct moduleren van genexpressie (bijvoorbeeld TAF eiwitten), of door het veranderen van de nucleosoom positionering (dwz chromatine complexen) of door het modificeren van andere histon residuen (bijvoorbeeld eiwitten met methyl-transferase of acetyl- transferase activiteit) (trans mechanismen) 5. De observatie dat verschillende PTM patronen cluster op specifieke chromatine loci geleid tot de uitwerking van de hypothese dat verschillende wijzigingen op verschillende plaatsen kan synergize een moleculaire code bemiddelen van de functionele staat van de onderliggende DNA te genereren. De "histoncode hypothese" heeft opgedaan grote consensus in de jaren, maar haar experimentele verificatie is tegengehouden door technische 6,7 beperkingen.
Massaspectrometrie (MS)-gebaseerde proteomics heeft ontpopt als eenkrachtig hulpmiddel om histonmodificatie patronen in kaart en chromatine-bindende eiwitten 8 karakteriseren. MS detecteert een wijziging als een specifieke Δmass tussen de experimentele en theoretische massa van een peptide. Op het niveau van individuele histonen, MS biedt een onbevooroordeelde en uitgebreide methode in kaart PTMs, waardoor de detectie van nieuwe veranderingen en onthullende wisselwerkingen tussen hen 9-14.
De laatste jaren zijn een aantal strategieën ontwikkeld om het proteomische samenstelling van chromatine ontleden, zoals de karakterisatie van intacte mitotische chromosomen 15, de identificatie van oplosbare Hptm bindingseiwitten 16-18 en de isolatie en analyse van specifieke chromatine gebieden (dwz telomeren) 19,20. Uit het onderzoek van de locus-specifieke synergieën tussen histon PTMs, varianten, en chromatine-geassocieerde eiwitten is nog onvolledig. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak, genaamd ChroP (Chro matin P roteomics) 21, die we hebben ontwikkeld voor het efficiënt karakteriseren functioneel verschillende chromatine domeinen. Deze aanpak past chromatine immunoprecipitatie (chip), een gevestigde protocol dat wordt gebruikt in epigenetisch onderzoek, voor de efficiënte MS-gebaseerde proteomics analyse van het verrijkte monster. We hebben twee verschillende protocollen ontwikkeld, afhankelijk van het type chromatine als input en door de lidstaten gemaakte vraag; in het bijzonder: 1) chip van de losgemaakte inheemse chromatine geknipt met MNase wordt gebruikt om mono-nucleosomen te zuiveren en de co-associëren hPTMs (N-ChroP) ontleden; 2) ChIP verknoopt chromatine gefragmenteerd door sonificatie wordt gebruikt in combinatie met een SILAC gebaseerde strategie interactomics alle co-verrijken chromatine bindende eiwitten (X-ChroP) te karakteriseren. We illustreren hier de combinatie van N-en X-ChroP voor het verrijken en het bestuderen heterochromatin, gebruik H3K9me3 als aas voor de immunoprecipitatie stappen. Het gebruik van ChroP kunnen worden uitgebreidofwel verschillende regio's op chromatine, of veranderingen in het chromatine samenstelling binnen dezelfde regio tijdens de overgang naar een andere functionele staat te bestuderen, waardoor de weg vrij voor verschillende toepassingen in de epigenetica.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben recent beschreven ChroP een kwantitatieve strategie voor de grootschalige karakterisering van de eiwitcomponenten van chromatine. ChroP combineert twee complementaire benaderingen gebruikt in de epigenetische veld, chip en MS, profiteren van hun sterke punten en het overwinnen van hun beperkingen. ChIP gekoppeld aan diepe sequencing (ChIP-Seq) maakt het genoom-brede kartering van histon modificaties aan de resolutie van enkele nucleosomen 35. Hoewel voordelig voor hun gevoeligheid, zijn op antilicha…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Mol Cell Proteomics. Soldi M. en Bonaldi T. De Proteomic Onderzoek van chromatine functionele domeinen Onthult Nieuwe synergieën tussen Verschillende Heterochromatine Components MCP. 2013; 12: 64-80. © de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Wij danken Roberta Noberini (Italian Institute of Technology en IEO, Italië) voor het kritisch lezen van het manuscript. TB werk wordt ondersteund door subsidies van de Giovanni Armenise-Harvard Foundation Career Development Program, de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. MS werk werd ondersteund door een FIRC fellowship.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
Referências
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
