ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ
Summary
ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。
Abstract
クロマチンは様々なDNA依存性プロセスを制御するDNAやタンパク質で作られた非常にダイナミックな核タンパク質複合体である。特定の領域におけるクロマチン構造および機能は、転写因子、およびDNAメチル化を含むヒストンの翻訳後修飾（hPTMs）および変異体、クロマチン結合タンパク質の局所的な濃縮によって調節される。個別の機能領域でのクロマチン組成のプロテオミクス特性評価は、これまで質量分析（MS）によるその後の詳細な分析のための適切な純度と量でそのようなドメインを豊かにするために、効率的なプロトコルの不足によって妨げられてきた。取クロマチン免疫沈降は、その機能、hPTMs、変異体および共同関連する非histonicタンパク質の面で明確なクロマチン領域を分離するために使用され、それによって我々は、ここにChroP（CHRO MATIN のP roteomics）という名前の新 たに設計されたクロマチンプロテオミクス戦略を、している記述MSにより分析した。我々は彼を説明ヒストンH3上のリシン9のトリメチル化の存在によってマークされた転写サイレントヘテロクロマチン領域に濃縮および分析のためのChroPのの設定、再。達成された結果は、徹底的にヘテロクロマチンプロテオームを特徴付けるChroPの可能性を実証し、クロマチンの異なるタンパク質決定因子が相互作用し、遺伝子座特異的構造的および機能的な構成を確立するために、相乗作用方法を理解するための強力な分析戦略としてそれを証明する。
Introduction
クロマチンはすべてのDNA媒介プロセスの主要なテンプレートとして関与している非常に動的な核タンパク質複合体である。ヌクレオソームはクロマチンの基本的な繰り返し単位であり、DNAの147塩基対が、1,2ラップ回される各カノニカルヒストンH2A、H2B、H3及びH4、2分子を含有するタンパク質性八量体コアからなる。すべてのコアヒストンは、ヌクレオソームの外に突出している球状ドメインで柔軟なN末端 「テール」として構成されている。クロマチン構造とダイナミクスを調節するための主要なメカニズムの一つは、主にヒストン3,4のN-末端に生じる共有結合性翻訳後修飾（PTMを）に基づいている。ヒストン修飾がヒストン-DNA間、またはヌクレオソーム間の接触を変化させることにより、高次クロマチン構造を変化させるため、DNA結合タンパク質（ シスメカニズム）のアクセスを制御することのいずれかによって機能することができ、又はdockinとして作用することにより調節タンパク質のために、単一のユニット、または多量体複合体に埋め込まれたようなグラム·サイト。そのような調節タンパク質は、異なる方法でその機能を発揮することができる：直接遺伝子発現（ すなわち、TAFタンパク質）を調節することによって、またはヌクレオソーム位置決め（ すなわち、クロマチンリモデリング複合体）を変えることにより、又は他のヒストン残基を修飾することにより（メチルトランスフェラーゼまたはアセチルを有する、すなわちタンパク質を転移酵素活性）（ トランスメカニズム）5。特定のクロマチン座で明確なPTMパターンクラスタは異なる部位で異なる修正が基本となるDNAの機能状態を仲介する分子コードを生成するために相乗作用がありという仮説の精緻化につながっていることを観察。 「ヒストンコード仮説は、「年間で大規模なコンセンサスを得ていますが、その実験的検証は技術的な限界6,7によって戻って開催されました。
質量分析（MS）ベースのプロテオミクスとして浮上しているヒストン修飾パターンをマッピングすると、クロマチン結合タンパク質8を特徴づけるための強力なツール。 MSは、ペプチドの実験と理論質量との間の特定のΔmassとして変更を検出します。個々のヒストンのレベルでは、MSは、それらの9月14日の間で新たな修正解きほぐすinterplaysの検出を可能に、PTMをマッピングする公平かつ包括的な方法を提供する。
近年、多くの戦略は、無傷の有糸分裂染色体15、可溶性hPTM結合タンパク質16-18の同定および特定のクロマチン領域の単離および分析の特徴付けを含む、クロマチンのプロテオミクス組成を分析するために開発されている（ すなわちテロメア）19,20。しかし、ヒストンPTMを、変異体、およびクロマチン関連タンパク質間の遺伝子座特異的相乗効果の調査はまだ不完全です。ここでは、（ChroPという名前の新しいアプローチを説明します我々は効率的に機能的に異なるクロマチンドメインを特徴づけるために開発されたことをCHRO MATIN のP roteomics）21。このアプローチは、濃縮されたサンプルの効率的なMSベースのプロテオミクス解析のために、クロマチン免疫沈降（チップ）、エピジェネティック研究に使用される十分に確立されたプロトコルを適応させる。我々は、入力およびMSによって対処かごとして用いるクロマチンの種類に応じて、2つの異なるプロトコルを開発した。特に：1）MNaseで消化した未定着ネイティブクロマチンのチップは、モノヌクレオソームを精製するとCO会合hPTMs（N-ChroP）を解剖するために採用されている。 2）超音波処理によって断片化、架橋クロマチンのチップは、タンパク質（X-ChroP）を結合すべての共同豊かクロマチンを特徴づけるSILACベースinteractomics戦略と組み合わせて使用されている。ここでは、免疫沈降ステップのための餌としてのH3K9me3を使用して、ヘテロクロマチンを豊かにし、研究するための、N-とX-ChroPの組み合わせを示している。 ChroPの使用が拡張することができるこのようにエピジェネティクスでの様々なアプリケーションへの道を切り開いて、明確なクロマチン上の領域、または別の機能的状態への移行時に、同じ領域内のクロマチン組成の変化のどちらかを研究する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は最近ChroP、クロマチンのタンパク質成分の大規模な特性評価のための定量的な戦略を記載している。 ChroPは、その強度から利益とそれぞれの限界を克服し、エピジェネティックなフィールドは、チップとMSで使用される2つの相補的なアプローチを組み合わせています。深いシーケンシング（チップ配列）に結合されたチップは、数ヌクレオソーム35の解像度でヒストン修飾のゲ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、もともとモル細胞プロテオミクスに掲載されました。 soldoの複数形M.およびクロマチン機能ドメインのBonaldi T.ザ·プロテオミクス研究は、異なるヘテロクロマチンコンポーネントのMCPの中で小説相乗作用を明らかにしている。 2013; 12：64-80。 ©生化学分子生物学のためのアメリカの社会。私たちは、原稿の重要な読書のためのロベルタNoberini（技術とIEOのイタリアの研究所、イタリア）に感謝。結核作業はジョバンニArmenise – ハーバード財団キャリア開発プログラム、がん研究のためのイタリアの協会と厚生労働省のイタリアからの補助金によってサポートされています。 MSの作業はFIRCフェローシップによってサポートされていました。
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
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