ChroP подход сочетает в себе чип и масс-спектрометрии для Рассеките Локус-специфические протеомные Пейзажи хроматина
Summary
Объединив родным и сшивания иммунопреципитацию хроматина с высоким разрешением масс-спектрометрии, ChroP подход позволяет препарировать композитный протеомный архитектуру модификаций гистонов, вариантов и не-histonic белков синергизма в функционально различных доменов хроматина.
Abstract
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов сделаны из ДНК и белков, который управляет различными процессами ДНК-зависимой. Структура хроматина и функции в конкретных регионах регулируется местного обогащения гистонов пост-трансляционных модификаций (hPTMs) и вариантов, хроматин-связывающих белков, в том числе факторов транскрипции, и метилирования ДНК. Протеомный характеристика хроматина композиции в различных функциональных областях был до сих пор препятствует отсутствие эффективных протоколов, чтобы обогатить таких доменов на соответствующем чистоты и количества для последующего углубленного анализа методом масс-спектрометрии (МС). Мы описываем здесь недавно разработанный стратегию хроматина протеомики, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics), в результате чего препарат иммунопреципитация хроматина используется для изоляции различных регионов хроматина, чьи черты лица, с точки зрения hPTMs, варианты и со-связанные не-histonic белки, являются анализируют методом МС. Проиллюстрируем онре создание ChroP для обогащения и анализа транскрипционно молчащих гетерохроматиновых районов, отмеченной присутствии три-метилирования лизина 9 гистона H3. Результаты, достигнутые продемонстрировать потенциал ChroP в тщательно характеризующий гетерохроматина протеома и доказать это в качестве мощного аналитического стратегии понимания того, как различные белковые детерминанты хроматина взаимодействовать и объединения усилий для установления структурных и функциональных конфигураций Локус-специфичные.
Introduction
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов, который участвует в качестве основного шаблона для всех процессов ДНК-опосредованной. Нуклеосом является основным повторяется единицей хроматина и состоит из белкового октамерных ядра, содержащего две молекулы каждого канонического гистона H2A, H2B, H3 и H4, вокруг которого 147 п.о. из ДНК, обернутой 1,2. Все основные гистоны структуру шаровой области и гибкой N-терминальном "хвосте", которая выступает за нуклеосоме. Одним из основных механизмов для регулирования структуры хроматина и динамику основана на ковалентных пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы), которые в основном происходят на N-концах гистонов 3,4. Модификации гистонов может функционировать либо путем изменения структуры более высокого порядка хроматина, изменяя контактов между гистонов ДНК или между нуклеосом, и таким образом контролировать доступность ДНК-связывающих белков (цис механизмов), или действуя как dockinг сайты для регуляторных белков, либо в виде отдельных единиц, или встроенный в мультимерных комплексов. Такие регулирующие белки могут оказывать свою функцию по-разному: путем модуляции экспрессии гена непосредственно (то есть TAF белки), или путем изменения позиционированием нуклеосом (т.е. хроматина комплексов) или путем модификации гистонов другие остатки (т.е. белки с метил-трансферазы или ацетил- трансферазы) (транс механизмы) 5. Наблюдение, что отличие PTM модели кластера в конкретной хроматина локусов привела к разработке гипотезы, что различные модификации в отдельных площадках, могут скоординированных генерировать молекулярную код посредническую функциональное состояние подстилающей ДНК. "Гистонов код гипотеза" получила большой консенсуса в эти годы, но ее экспериментальная проверка была сдерживается техническими ограничениями 6,7.
Протеомика Масс-спектрометрия (МС) на основе сталамощный инструмент для сопоставления гистонов моделей модификации и охарактеризовать хроматина-связывающие белки 8. MS обнаруживает изменение в качестве конкретного Δmass между экспериментальной и теоретической массы пептида. На уровне отдельных гистонов, MS предоставляет непредвзятый и всесторонний метод для сопоставления PTMs, что позволяет обнаруживать новые модификации и выявление взаимодействий между ними 9-14.
В последние годы ряд стратегий были разработаны препарировать протеомный состав хроматина, в том числе характеристики нетронутыми митотических хромосом 15, идентификации растворимых hPTM-связывающих белков 16-18 и выделения и анализа конкретных регионах хроматина (т.е. теломеры) 19,20. Тем не менее, исследование локус-специфических синергии между гистонов PTMs, вариантов и ассоциированных с хроматином белков еще не завершен. Здесь мы описываем новый подход, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics) 21, которые мы разработали для эффективного характеризуют функционально различных доменов хроматина. Этот подход адаптируется иммунопреципитацию хроматина (чип), хорошо налаженные протокол, используемый в эпигенетической исследования, для эффективного МС на основе протеомики анализа обогащенного образца. Мы разработали две различные протоколы, в зависимости от типа хроматина, используемого в качестве входных данных и вопроса, адресованного МС; в частности: 1) чип нефиксированной родной хроматина переваренной MNase используется для очистки моно-нуклеосом и препарировать совместно, связывающие hPTMs (N-ChroP); 2) чип сшитого хроматина фрагментированы с помощью ультразвука используется в сочетании с SILAC основе interactomics стратегии, чтобы охарактеризовать все совместно обогащая хроматин-связывающих белков (X-ChroP). Проиллюстрируем здесь сочетание N-и X-ChroP для обогащения и изучения гетерохроматина, используя H3K9me3 в качестве приманки для шагов иммунопреципитации. Использование ChroP может быть продленучиться либо отдельные области на хроматина, или изменения в хроматина состава в пределах одного региона при переходе к другой функционального состояния, тем самым проложив путь к различным приложениям в эпигенетика.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы недавно описал ChroP, количественную стратегию масштабного характеристики белковых компонентов хроматина. ChroP сочетает в себе два взаимодополняющих подходов, используемых в эпигенетической области, Чип и магистра, прибыль от их сильных и преодоления их соответствующие ограничения. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было впервые опубликована в Mol Cell протеомики. Soldi М. и Bonaldi Т. Протеомный Исследование хроматина функциональных областей показывает Novel синергизм среди Отдельное гетерохроматина Компоненты MCP. 2013; 12: 64-80. © Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Мы благодарим Роберта Noberini (Итальянский технологический институт и НОО, Италия) за критическое прочтение рукописи. Работа ТБ поддерживается грантами Armenise Гарвард-Foundation Программы Джованни Career Development, итальянской ассоциации по исследованию рака и Министерства здравоохранения Италии. MS Работа выполнена при поддержке стипендии FIRC.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
Referências
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
