ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir
Summary
Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.
Abstract
Kromatin çeşitli DNA-bağımlı işlemlerini denetleyen DNA ve proteinlerden oluşan bir derece dinamik Nukleoprotein karmaşıktır. Belirli bölgelerdeki kromatin yapısı ve fonksiyonu transkripsiyon faktörleri ve DNA da dahil olmak üzere metilasyon histon post-translasyonel modifikasyonlar (hPTMs) ve türevleri, kromatin bağlayıcı proteinler, lokal zenginleşmesi ile düzenlenir. Farklı fonksiyonel bölgelerde kromatin kompozisyon proteomik karakterizasyonu kadar kütle spektrometresi (MS) tarafından daha sonraki derinlemesine analiz için uygun saflıkta ve miktarda bu tür etki zenginleştirmek için verimli protokollerin olmaması engel olmuştur. Biz burada, hazırlayıcı Kromatin immüno-çökeltme, özellikleri, hPTMs açısından, varyantları ve co-ilişkili olmayan proteinler ayrı histonic kromatin bölgeleri izole etmek için kullanılır ve bu arada ChroP (Chro kaska roteomics P) olarak adlandırılan, yeni tasarlanmış kromatin proteomik strateji tarif MS ile analiz edilmiştir. Biz he göstermekhiston H3 lizin 9 arasında tri-metilasyon varlığı ile işaretlenir transkripsiyonel sessiz heterokromatik bölgelerin zenginleştirme ve analizi için ChroP kurulmasına re. Elde edilen sonuçlar iyice heterokromatinin proteomesini karakterize ve kromatin farklı protein belirleyicileri etkileşim ve lokus spesifik yapısal ve işlevsel yapılandırmaları kurmak synergize nasıl anlamak için güçlü analitik strateji olarak bunu kanıtlamak içinde ChroP potansiyelini göstermektedir.
Introduction
Kromatin bütün DNA dolayımlı süreçler için temel şablon olarak dahil olan bir yüksek dinamik bir nükleoprotein karmaşıktır. Nükleozom kromatin temel tekrarlanan birimi olan ve DNA 147 bp 1,2 sarılır etrafında her bir kanonik histon H2A, H2B, H3 ve H4, iki protein molekülü ihtiva eden bir oktamer çekirdek oluşur. Tüm çekirdek histon bir küresel etki ve nükleozom dışında çıkıntı esnek bir N-terminal "kuyruk" olarak yapılandırılmıştır. Kromatin yapısı ve dinamikleri düzenlenmesi için önemli mekanizmalardan biri esas olarak histon 3,4 N-uçlarının üzerinde meydana gelen kovalent bir post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. Histon modifikasyonlar histon-DNA arasında veya nükleozom arasında temas değiştirerek, yüksek dereceli kromatin yapısını değiştirmeden ve böylece DNA-bağlayıcı proteinler (sis mekanizmaları) erişilebilirliğini kontrol edilmesi yoluyla işlev görebilir ya da dockin olarak hareket ederekdüzenleyici proteinler için, ya da tek bir birim ya da multimerik kompleksleri gömülü olarak g siteleri. Bu gibi düzenleyici proteinlerin farklı şekillerde işlev gösterebilir: doğrudan gen ifadesi (örneğin, TAF proteinleri) modüle edilmesiyle, ya da nükleozom konumlandırma (yani kromatin kompleksler yeniden) değiştirerek ya da başka bir histon artıkları (metil-transferaz ya da örneğin proteinler asetil-değiştirerek transferaz aktivitesi) (trans mekanizmaları) 5. Belirli kromatin loci farklı PTM desenler küme farklı sitelerde farklı modifikasyonlar yatan DNA'nın fonksiyonel durumunu aracılık moleküler kodu üretmek için sinerji olabilir hipotezin hazırlanmasına neden olduğunu gözlem. "Histon kodu hipotezi" yıllarda büyük uzlaşma kazanmıştır ancak deneysel doğrulama teknik sınırlamalar 6,7 ile geri düzenlenen olmuştur.
Kütle spektrometrisi (MS) bazlı bir proteomik olarak ortaya çıkmıştırgüçlü bir araç histon modifikasyonu desenleri haritasına ve kromatin-bağlayıcı proteinlerin 8 karakterize etmek. MS bir peptidin deneysel ve kuramsal kütle arasında belirli bir modifikasyonunu Δmass olarak tespit eder. Bireysel histonların seviyesinde, MS bunların 9-14 arasında yeni modifikasyon ve açığa etkileşimlere saptanmasını sağlayan, PTMS eşlemek için bir ilgili ve kapsamlı bir yöntem sağlar.
Son yıllarda, bir dizi strateji sağlam mitotik kromozom 15, çözünür HPTM bağlayıcı proteinlerin 16-18 tanımlanmasında ve özel kromatin bölgelerin izolasyonu ve analiz karakterizasyonu dahil olmak üzere, kromatin proteomik bileşimini incelemek için geliştirilmiştir (örneğin telomer) 19,20. Ancak, histon PTMS, varyantları ve kromatin ile ilişkili proteinler arasındaki lokus spesifik sinerji soruşturma hala tamamlanmadı. Burada, biz (ChroP adında yeni bir yaklaşım, tarifBiz verimli, fonksiyonel olarak farklı kromatin alanları tanımlamak için gelişmiş olduğunu Chro matin P roteomics) 21. Bu yaklaşım, zenginleştirilmiş numunenin etkin MS-tabanlı proteomik analizi için Kromatin immüno-çökeltmesi (çip), epigenetik araştırmalarda kullanılan köklü bir protokol, uyum sağlar. Bu giriş ve MS ile ele alınan sorun olarak kullanılan kromatin türüne bağlı olarak, iki farklı protokol geliştirdik; özellikle: MNase ile sindirilmiş sabitlenmemiş yerli kromatin 1) yonga mono-nükleozom arındırmak ve ko-ilişkilendirme hPTMs (N-ChroP) incelemek için kullanılır; 2) sonikasyon ile parçalanır çapraz bağlantılı kromatin ChIP proteinleri (X-ChroP) bağlayıcı tüm eş zenginleştirmek kromatin karakterize etmek için bir SILAC bazlı interactomics stratejisi ile kombinasyon halinde kullanılır. Biz burada İmmünopresipitasyon adımlar için yem olarak H3K9me3 kullanarak, heterokromatine zenginleştirmek ve eğitim için N-ve X-ChroP kombinasyonunu göstermektedir. ChroP kullanılması uzatılabilirBöylece epigenetik çeşitli uygulamalara önünü, ayrı kromatin bölgeleri, ya da farklı bir işlevsel durumuna geçiş sırasında aynı bölge içinde kromatin bileşimindeki değişiklikleri ya çalışmak için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yakın zamanda ChroP, kromatin protein bileşenlerinin büyük ölçekli karakterizasyon için nicel bir strateji tarif edilmiştir. ChroP epigenetik alanında kullanılan iki tamamlayıcı yaklaşımlar, Chip ve MS, güçlerini istifade ve kendi sınırlarını aşma birleştirir. Derin dizileme (ChIP-Seq) birleştiğinde ChIP birkaç nükleozomların 35 çözünürlükte histon modifikasyonları genom haritalama sağlar. Duyarlılık için avantajlı olsa da, antikor-bazlı deneyler benzer değişiklikler a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma aslında Mol Cell Proteomics yayınlandı. Soldi M. ve Kromatin Fonksiyonel Alanlar Bonaldi T. Proteomic İncelenmesi Farklı Heterokromatin Bileşenler MCP arasında Roman birlikteliğini ortaya çıkarır. 2013; 64-80: 12. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için American Society. Biz yazının eleştirel okuma için Roberta Noberini (Teknoloji ve Ieo İtalyan Enstitüsü, İtalya) teşekkür ederim. TB iş Giovanni Armenise-Harvard Vakfı Kariyer Geliştirme Programı, Kanser Araştırma ve İtalyan Sağlık Bakanlığı için İtalyan Derneği hibe tarafından desteklenmektedir. MS çalışma Firc burs ile desteklenmiştir.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
Referências
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
