在这里,我们描述的同时产生神经前体细胞培养的一个详细的协议,因为无论是贴壁单层或神经球,从脑室下区和个体成年小鼠海马齿状回。
神经球法和贴壁单层培养系统是有价值的工具,以确定潜在的成体神经干细胞的体外 (细胞增殖或分化)。这些测定法可用于比较的细胞从遗传上不同或差分处理的动物中分离的前体电位,以确定外源因素对神经前体细胞的增殖和分化的影响,并产生可被检测过的连续传代的神经前体细胞系。神经球法是传统上用于事后识别干细胞,主要是由于缺乏明确的标记,使他们能够从主组织中分离出来,并具有使前体细胞数的快速估计脑组织中的主要优点来源于动物个体。贴壁单层培养物,与此相反,没有传统上用来比较个别动物之间的扩散,因为每一种文化一般是由动物的5-8之间的联合组织发起的。然而,它们具有不同于神经球,它们由前体细胞的一个主要同质种群的和是在单细胞以下的分化过程有用的主要优势。在这里,我们描述,详细地说,神经球培养物的产生,并在第一次,从个别动物贴壁培养物。这具有多方面的重要意义,包括在这两个脑室下区(SVZ)和处理过的或遗传上不同小鼠品系的齿状回(DG)增殖和/或分化潜能的配对分析,以及一个显著减少动物的使用。
神经球试验1,2和贴壁单层培养3,4,在90年代初发达国家,仍留在体外神经干细胞检测的金标准。在这些测定中,主要的组织是微从特定脑区域解剖,解离成单细胞悬浮液,并在有丝分裂原表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长的存在下培养因子-2(FGF2),以形成任一自由浮动的集群(神经球)或贴壁单层。这两个系统有一些优点和缺点,并小心,应考虑到的是一个或另一个系统被选择之前必须解决的问题。
神经球允许一个简单的读出的前体细胞数和电位差。此外,神经球也从它们的正常的外部环境中取出时,研究细胞的内在规范的有用工具。 Extrin原文线索可以通过简单地增加所关心的生长培养基中的因子和量化所产生的神经球的数目和大小来研究。神经球的主要缺点然而,就是它们形成自己的特殊的,与细胞的神经球(特别大的神经球)比那些表面5上更加分化的中心。神经球含有干细胞,致力于祖细胞,并且分化的细胞及神经球内的细胞 – 细胞相互作用抵消干细胞的维持的混合。这就是为什么神经球只包含少数真正的干细胞6-8中。
单层贴壁培养也提供了良好的体外系统在体内增殖模型。贴壁培养,其中的细胞保持更加孤立且均匀,能消除神经球的异质性。在这些生长条件下的前体细胞增殖RAPIDLY和几乎所有的细胞分裂和表达特征的神经前体标志物巢蛋白,Sox2和BLBP。对单层培养系统相比,神经球试验中的主要缺点是单个前体衍生的克隆都无法被监控和量化。
大多数协议的这两种类型的培养物的一个缺点一直是使用相对大量的动物的必要性,因为隔离策略的产率往往是很差。在同一时间,它已经很清楚,成年神经有助于大脑9的个性化,导致需要进行个性化的体外模型为好。本报告中所述的这些需求能够得到满足的“一鼠一文化”的协议。
下面的视觉协议描述的同时产生的动物个体都SVZ和DG无论是作为粘附米的神经前体文化onolayers或神经球。从动物个体培养物的产生是当需要单独处理的动物或各种单个转基因或野生型小鼠之间进行比较时特别有用。这个协议包括用于从成年小鼠的SVZ和DG区的同时显微切割的详细说明,其解离成单细胞悬液, 在体外培养的任何贴壁单层培养物或神经球和multipotentiality和长期潜力的分析,两个基数一个真正的骨干细胞的特性。
本文提出了神经前体的文化,无论是作为单层贴壁和神经球,从成年小鼠大脑的两个主要神经区的启动一个详细的协议。有一些必须在尝试要么这些在体外培养系统中时,必须牢记的重要的点。首先,分离方法的选择是非常重要的,是组织依赖。在我们手中,0.05%胰蛋白酶-EDTA是非常有效的SVZ组织的离解,结果在许多神经球的更高利用木瓜蛋白酶为基础的分解方法时比。对于危险品组织的分解然而,我们强烈建议木瓜蛋白酶为基础的分离方法。当直接比较对DG组织两个分离的方法,我们观察到活细胞的一个显著产量较低,大约使用胰蛋白酶时10倍更少的神经球。在解离这种差异可能是由于在组织构成项目的差两个地区之间的ñ。危险品的紧凑型组织是由大量的神经纤维包围和细胞过程的广泛损害可发生解离过程中。
要注意的第二个重要点是,虽然神经球法可以做出关于存在于给定组织样品中的前体细胞的数目定量陈述有用,有些必须谨慎,但是,在这些绝对数字的解释使用。神经球的融合可以是一个主要的混杂因素。一些研究表明,神经元是高度运动,并且可以熔化,甚至在什么是所谓“克隆”条件7,19。将得到的神经球的频率可以非常依赖于因素,包括培养基成分,解剖过程和离解过程。即使是经验丰富的处理从假定相同的样品产生的神经球的数量有些变化是明显的( 见图1A。)更多有用的,是两个给定的样本( 即控制与处理或野生型与基因敲除)处理由同一个人在同一个实验,而不是总的定量语句之间的前体频率的直接比较前体细胞数。
当决定哪两个培养方法是最适合于特定的实验是要注意,这两种培养系统中产生的细胞类型的均匀性差是重要的。相比,增殖贴壁细胞培养物,其显示出相当均匀的前体细胞池(〜98%的细胞是Sox2的+)20,神经球更异构和包含,以及增殖前体细胞,分化的神经元,星形胶质细胞和21,22。这是很重要的神经球是不是为通道之间的长时间,作为更大的培养的神经球变得越有可能是找到在其核心分化的细胞类型。
传统上,我们开始从5-8之间的小鼠DG组织单层贴壁神经前体文化。因此,尝试建立从一个单一的鼠标的DG或SVZ的单层贴壁培养时,悉心照顾需要组织解离过程中应采取以避免在组织研制过程中过量引起的细胞死亡,或采取延长解剖和最终培养步骤之间的时间段。这个协议描述,对于第一次,从个别动物两者的SVZ和DG贴壁单层培养物的前体的生成。有许多情况需要在一个单一的动物基础制成的前体的增殖和分化的比较时。这些措施包括,以直接比较DG和使用统计数据配对动物个体的SVZ和配对的个体行为或生理数据9文化数据的能力。单个动物的文化也人低遗传关联研究利用难得的转基因动物,其中年龄匹配的每个文化5-8捐助池是不可能的,以及独特的动物( 如 F2杂交或出繁殖的动物)的。
The authors have nothing to disclose.
特力屋是由居里夫人国际来电奖学金支持。这项工作也从基本的制度资金拨付,Bundesministerium毛皮教化和Forschung(BMBF)资助,部分与支持优先研究发展计划(SFB)655到GK。作者要感谢安妮Karasinsky的保养和维护在这项研究中使用的所有动物和奥黛特雷特,苏珊Ruhwald,范妮博梅和理查德·韦策尔的细胞培养和显微镜的帮助。
CONSUMABLES | |||
poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
laminin | Roche | 11243217001 | |
glass pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
DMEM:F12 (1:1) 1X | Life Technologies | 21331-020 | |
Neural Basal Medium (1X) | Life Technologies | 21103-049 | |
B27 supplements (50X) | Life Technologies | 17504-044 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-038 | |
Heparain | Sigma | H3393 | |
Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Papain | Worthington | LS003120 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS (with Calcium & Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
Glucose | Roth | X997.2 | |
HEPES | Sigma | H3375-500G | |
NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
1mL syringes | Braun | 2016-10 | |
27 Gauge needles | Braun | 4657705 | |
scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
scissors | FST | 14060-10 | |
Iris spatula | FST | 10093-13 | |
70% ethanol | |||
PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
flasks/well plates | TPP | 92696 | |
PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
NDS | Millipore | 530 | |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
O4 | R & D systems | MAB1326 | |
Map2a+b | Sigma | M1406 | |
donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
10 ml Combi tips | eppendorf | 30089677 | |
plastic 10ml and 25mL serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
EQUIPMENT | |||
Pipetboy | Integra biosciences | 521942 | |
multidoser pipette | eppendorf | ||
37C waterbath | |||
dissecting microscope | |||
37C:5%Co2 incubator | |||
centrifuge | eppendorf | 5810R |