בVivo siRNA Transfection וג'ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים
Summary
דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה ומהירה של נקב מחט intrathecal עבור transfection מקומי של siRNA בחוט השדרה המותני בעכבר תחת הרדמה קצרה אור בר קיימא.
Abstract
דו"ח זה מתאר את מדריך צעד אחר צעד לטכניקה של הזרקות מחט intrathecal חריפות בצורה לא פולשנית, כלומר העצמאית של השתלת קטטר. המגבלה הטכנית של טכניקה ניתוחית זו נעוצה בעידון של הידיים. הזריקה היא מהירה, במיוחד עבור הנסיין מיומן, וכן שיבוש רקמות עם טכניקה זו הוא מינימאלי, זריקות חוזרות ונשנות אפשריות; תגובת יתר על כן חיסון לכלים זרים (. למשל קטטר) אינה מתרחשת, ובכך נותנת ספציפי טוב יותר ויותר לקרוא את של אפנון חוט השדרה. מאז היישום של החומר מוגבל במידה רבה לאזור היעד של חוט השדרה, תרופות לא צריכה להיות מיושמות במינונים גדולים, ואת השפעות חשוב יותר לא רצויות ברקמות אחרות, כפי שנצפתה עם משלוח מערכתי, יכולה לעקוף 1, 2. יתר על כן, אנו משלבים בטכניקה זו עם transfection vivo של חומצות גרעין בעזרת polyethylenimine (PEI) מגיב 3, המספק גמישות עצומה ללימוד פונקציות השדרה באמצעות משלוח של סוכנים תרופתיים כמו גם גנים, RNA, ומאפנני חלבון.
Introduction
חוט השדרה הוא מרכז חשוב מאוד במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים מרכזיים ופונקציות פיסיולוגיות, לרבות עיבוד והעברה של תשומות כואבות (nociceptive) 4-7. ניסיוני בטכניקות שונות פותחו כדי להקל על אפנון תרופתי של חוט השדרה, כגון השתלה כרונית של צנתרים intrathecal 8, microinjection חוט השדרה, והזרקת מחט intrathecal 9. לכל אחד יש טכניקת יתרונות משלה וחסרונות, ובהתאם לפרדיגמה ניסוי טכניקה אחת יכולה להיות מתאימה יותר מאשר לאחרים. ואילו השתלה כרונית של צנתרים intrathecal אינה ריאלי בקלות בחולדה, בשיטה זו קשה מאוד בעכבר, בהתחשב במגבלות גודל. שיעור הצלחה הוא נמוך מאוד וליקויים מוטוריים מתרחשים לעתים קרובות בשל נוכחותם מגושמת של קטטר בחלל subdural מוגבל קשות בעכבר. יתר על כן, מסירה ארוכת טווח של תרופות שניתנו עקב קרישה תכופהשל כרוני מושתל צנתרים. לבסוף, תגובות חיסוניים נפוצות.
ניתן לעקוף בעיות אלה תוך שימוש בשיטה של הזרקת intrathecal האקוטית באמצעות מחט בהעדר קטטר preimplanted, המאפשר יישום מהיר ואנטומית מוגבל של תרופות וחומרים כימיים למייתרי השדרה בעכברים. שיטה זו שומרת באופן מלא את היתרונות של משלוח intrathecal על פני מסלולים אחרים מערכתיים משלוח (לדוגמא: דרך הפה, דרך הווריד, החדרה לקרום בטן, וכו ') כגון הספציפיות של אפנון בעמוד השדרה, המאפשר מינונים מופחתים ותופעות לוואי גבול, כמו גם יכולת לספק חומרים לא בדרך כלל לא חוצה את מחסום דם במוח מאז במהלך הזרקת intrathecal, המחט מוחדרת בין מאטר הדורה וחוט השדרה. חשוב לציין עם זאת, בהשוואה לשיטות אחרות של משלוח intrathecal, שיטת הזרקת מחט intrathecal היא פחות פולשנית, המאפשר יישומים רביםאותו בעל חיים מבלי לגרום כל נזק לרקמות משמעותיות או לעורר תגובה חיסונית עקב השתלה של חומר זר. עם זאת, זה דורש מיומנות טכנית למיקוד מדויק מאוד של המחט על מנת לאפשר יעילות.
הנה, אנחנו מבחינה ויזואלית להדגים את השיטה להשגת שיעור אופטימלי של הצלחה עבור במיוחד מיקוד בעמוד השדרה המותני. אתר הזרקה שנבחרה בניסוי הזה הוא החריץ בין L5 והעמודה L6 חוליות, סמוך למקום שבי חוט השדרה מסתיים, כדי למזער את האפשרות של פגיעה בעמוד השדרה. יתר על כן, אנחנו מדגימים את השימוש בטכניקה זו כדי להפיל גנים בחוט השדרה באמצעות siRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
לכן, השיטה שתואר לעיל של זריקות מחט intrathecal היא יעילה, מהירה, במיוחד-מקומי, ולא הורסות. מבחינה טכנית, ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא נקודת החדרת מחט לתוך החריץ. זה חיוני כי הליך זה נעשה עם ידיים וסבלנות מאוד רגועות. כמו רבים הליכים כירורגיים, אימון משפר את קצב הזריקה מו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referências
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neurociência. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
