마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에
Summary
이 보고서는 짧은 지속 가벼운 마취 쥐의 요추 척수의 siRNA의 지역화 된 형질에 대한 막내 바늘 구멍의 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.
Abstract
이 보고서는 비 침습적 인 방법으로 급성 경막 바늘 주사의 기술, 카테터 주입, 즉 독립적 인 방법을 단계별로 설명합니다. 이 수술 기법의 기술적 한계는 손의 기교에있다. 주입은 특히 숙련 된 실험자에 대한 신속하고,이 기술과 조직의 혼란을 최소화하기 때문에 반복 주사가 가능합니다; 외국 도구 또한 면역 반응 (. 예 카테 테르)는 발생하지 않습니다, 따라서 더 많은 특정를 읽기 제공 척수 변조. 물질의 응용이 크게 척수의 타깃 영역에 한정되기 때문에, 약물은 큰 투여 량에 적용될 필요가 없으며, 다른 조직에 더 중요하게 원치 않는 효과는, 전신 전달 관찰로, 1 피할 수 2. 또한, 우리는 polyethylenim의 도움으로 핵산의 생체 내 형질과이 기술을 결합오프라인 (PEI)되는 약물의 전달뿐만 아니라 유전자, RNA, 단백질 변조기를 통해 척추의 기능을 연구하는 엄청난 다양성을 제공 시약 3.
Introduction
척수 처리 및 통증 (통각) 입력 4-7의 전송 등 주요 생물 학적 과정과 생리 기능의 다양한 매우 중요한 중심지입니다. 다양한 실험 기술들은 척수강 내 카테터 13의 주입 만성 척수 마이크로 인젝션, 및 경 막내 주사 바늘 15 등의 척수의 약리학 적 변조를 용이하게하기 위해 개발되어왔다. 각각의 기술은 자신의 장점과 단점을 가지고 있으며, 실험 패러다임에 따라 하나의 기술은 다른 사람보다 더 적합 할 수 있습니다. 척수강 내 카테터의 만성 주입 쥐에서 쉽게 가능한 반면,이 방법은 크기 제한 주어진 마우스에 매우 어렵습니다. 성공률은 매우 낮은 모터 적자 인해 종종 마우스에서 심각하게 제한 경막 하 공간에 카테터의 부피가 큰 존재로 발생합니다. 또한, 약물의 장기로 인해 납기가 자주 응고에 렌더링만성적으로 카테터를 주입. 마지막으로, 면역 반응이 일반적이다.
이러한 문제는 생쥐의 척수에 약물 및 시약의 빠르고 해부학 제한된 애플리케이션을 가능 preimplanted 카테터의 부재에서 바늘을 통해 급성 경 막내 주입 방법을 사용하여 회피 될 수있다. 이 방법은 완전히 같은 척추 감소 투여 량 및 제한 부작용을 허용 변조뿐만 아니라 물질 그렇지 전달 능력의 특이성 등의 전신 전달 경로 (예 : 경구, 정맥 내, 복강 내 등) 위에 경 막내 전달의 장점을 유지 척수강 내 주입하는 동안 바늘이 경막과 척추 사이에 삽입되어 있기 때문에 일반적으로 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않습니다. 중요한 그러나, 경 막내 대금의 다른 방법에 비해, 척수강 내 바늘 주입 방법은 수많은 응용을 허용 최소 침습어떤 상당한 조직 손상을 일으키는 원인이 나 때문에 이물질의 주입에 면역 반응을 불러 일으키는없이 같은 동물. 그러나, 효능을 허용하는 바늘의 매우 정확한 타겟팅에 대한 기술 능력을 필요로한다.
여기, 우리는 시각적으로 구체적으로 요추 척수를 대상에 대한 성공의 최적의 속도를 달성하기위한 방법을 보여줍니다. 이 실험에서 선택 주사 부위는 L5 척추의 손상의 가능성을 최소화하기 척수 끝나는 곳에 가까운 L6 척추 칼럼 사이의 홈이다. 또한, 우리는 siRNA를을 사용하여 척수 유전자를 노크하는이 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
따라서, 경 막내 주사 바늘의 상술 기법은 효과적 빠르고 구체적 지역화 및 비파괴이다. 기술적으로,이 절차의 가장 중요한 측면은 홈에 바늘 삽입의 포인트입니다. 그것은이 절차는 매우 침착 손과 인내심을 가지고 수행하는 것이 중요합니다. 많은 수술과 마찬가지로 훈련은 성공적으로 주입의 속도를 향상시킵니다. 실제의 실험 기간 동안,이 방법은 직접 주입이 성공인지 아닌지 확인하는 명백…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referências
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neurociência. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
