Nevronale membran menneskehandel dynamisk styrer plasma membran protein tilgjengelighet og betydelig påvirker nevrotransmisjon. Til dags dato har det vært utfordrende å måle nevronale endocytic menneskehandel i voksen nevroner. Her beskriver vi en svært effektiv, kvantitativ metode for å måle hurtige forandringer i overflateprotein ekspresjon ex vivo i akutte hjerneskiver.
Regulert endocytic trafficking er den sentrale mekanismen tilrettelegge en rekke neuromodulatory hendelser, ved dynamisk styring reseptor, ionekanal, og transporter celleoverflaten presentasjon på en minutters tidsskala. Det er et bredt mangfold av mekanismer som styrer endocytic smugling av enkelte proteiner. Studier som undersøker de molekylære grunnlaget for menneskehandel har først og fremst stole på overflaten biotinylering å kvantitativt måle endringer i membran protein overflate uttrykk som svar på eksogene stimuli og genmanipulering. Imidlertid har denne tilnærmingen i hovedsak vært begrenset til dyrkede celler, noe som kanskje ikke trofast gjenspeiler de fysiologisk relevante mekanismer som spiller inn i voksen nevroner. Videre kan dyrkede celle tilnærminger undervurdere regionsspesifikke forskjeller i trafficking mekanismer. Her beskriver vi en tilnærming som strekker celleoverflaten biotinylering til den akutte hjernen skive forberedelse. Viviser at denne metoden gir et high-fidelity tilnærming for å måle raske endringer i membranproteinoverflatenivået hos voksne nevroner. Denne tilnærmingen er sannsynlig å ha bred nytte innen nevronale endocytic menneskehandel.
Endocytic menneskehandel er en allestedsnærværende cellulær mekanisme som fintuner plasma membran presentasjon av en rekke integrerte membran proteiner. Endocytose gir viktige næringsstoffer til det intracellulære miljøet 1 og desensitizes reseptor signal som respons på reseptoraktivering 2.. Endocytic resirkulering tilbake til plasmamembranen kan i tillegg øke cellulær signalisering ved å øke protein uttrykk nivåer på celleoverflaten 3.. Videre er membran trafficking forstyrrelsene innblandet i en rekke sykdommer og patologiske tilstander 4,5, understreker behovet for å undersøke de molekylære mekanismer som styrer protein endocytic menneskehandel. Mens mange proteiner utnytte klassiske clathrin avhengige internalise mekanismer, monterings bevis i løpet av de siste årene viser at flere clathrin uavhengig endocytiske mekanismer styrer endocytic potensialet i et økende utvalg avproteiner 6,7. Dermed har behovet for å undersøke endocytiske mekanismer tilrettelegge menneskehandel i fysiologiske relevante systemer vokst betraktelig.
I hjernen har endocytic smugling av reseptorer, ionekanaler og nevrotransmitter transportører en primær rolle i etableringen av synaptisk plastisitet 8-11 og respons til narkotika misbruk 12-15, til syvende og sist påvirker nevronal eksitabilitet og synaptiske responser. Hittil flertallet av nevrale trafficking studier er avhengige av enten heterologe ekspresjonssystemer eller dyrkede primære nevroner, kan verken som pålitelig reflektere mekanismer som spiller inn i voksen nevroner. Her rapporterer vi en tilnærming som bruker overflaten biotinylering å kvantitativt måle overflateproteinnivåer i akutte hjernen skiver avledet fra voksne gnagere. Ved hjelp av denne tilnærmingen, presenterer vi data som viser at musen striatal dopamin transporter internalizes raskt i resom reaksjon på phorbol ester-mediert protein kinase C (PKC) aktivering.
Til tross for lang erfaring som endocytic menneskehandel kritisk påvirker synaptiske signalering i hjernen, har det vist seg utfordrende å kvantitativt måle endringer i protein overflate uttrykk hos voksne nevroner. I dette arbeidet, rapporterer vi en pålitelig tilnærming til å merke overflateprotein ex vivo i akutte hjernen skiver. Brain slice forberedelser har en lang historie av verktøy for elektrofysiologiske opptak, som de opprettholder synaptiske forbindelser og celleviabilitet opptil timer etter t…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd DA15169 og DA035224 til HEM
sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
Vibrating microtome sectioner | Various | ||
Shaking water bath | various | ||
Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |