Brain Slice Biotinvlerina: An<em> Ex Vivo</em> Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Summary

Nevronale membran menneskehandel dynamisk styrer plasma membran protein tilgjengelighet og betydelig påvirker nevrotransmisjon. Til dags dato har det vært utfordrende å måle nevronale endocytic menneskehandel i voksen nevroner. Her beskriver vi en svært effektiv, kvantitativ metode for å måle hurtige forandringer i overflateprotein ekspresjon ex vivo i akutte hjerneskiver.

Abstract

Regulert endocytic trafficking er den sentrale mekanismen tilrettelegge en rekke neuromodulatory hendelser, ved dynamisk styring reseptor, ionekanal, og transporter celleoverflaten presentasjon på en minutters tidsskala. Det er et bredt mangfold av mekanismer som styrer endocytic smugling av enkelte proteiner. Studier som undersøker de molekylære grunnlaget for menneskehandel har først og fremst stole på overflaten biotinylering å kvantitativt måle endringer i membran protein overflate uttrykk som svar på eksogene stimuli og genmanipulering. Imidlertid har denne tilnærmingen i hovedsak vært begrenset til dyrkede celler, noe som kanskje ikke trofast gjenspeiler de fysiologisk relevante mekanismer som spiller inn i voksen nevroner. Videre kan dyrkede celle tilnærminger undervurdere regionsspesifikke forskjeller i trafficking mekanismer. Her beskriver vi en tilnærming som strekker celleoverflaten biotinylering til den akutte hjernen skive forberedelse. Viviser at denne metoden gir et high-fidelity tilnærming for å måle raske endringer i membranproteinoverflatenivået hos voksne nevroner. Denne tilnærmingen er sannsynlig å ha bred nytte innen nevronale endocytic menneskehandel.

Introduction

Endocytic menneskehandel er en allestedsnærværende cellulær mekanisme som fintuner plasma membran presentasjon av en rekke integrerte membran proteiner. Endocytose gir viktige næringsstoffer til det intracellulære miljøet ¹ og desensitizes reseptor signal som respons på reseptoraktivering ^2.. Endocytic resirkulering tilbake til plasmamembranen kan i tillegg øke cellulær signalisering ved å øke protein uttrykk nivåer på celleoverflaten ^3.. Videre er membran trafficking forstyrrelsene innblandet i en rekke sykdommer og patologiske tilstander ^4,5, understreker behovet for å undersøke de molekylære mekanismer som styrer protein endocytic menneskehandel. Mens mange proteiner utnytte klassiske clathrin avhengige internalise mekanismer, monterings bevis i løpet av de siste årene viser at flere clathrin uavhengig endocytiske mekanismer styrer endocytic potensialet i et økende utvalg avproteiner ^6,7. Dermed har behovet for å undersøke endocytiske mekanismer tilrettelegge menneskehandel i fysiologiske relevante systemer vokst betraktelig.

I hjernen har endocytic smugling av reseptorer, ionekanaler og nevrotransmitter transportører en primær rolle i etableringen av synaptisk plastisitet ^8-11 og respons til narkotika misbruk ^12-15, til syvende og sist påvirker nevronal eksitabilitet og synaptiske responser. Hittil flertallet av nevrale trafficking studier er avhengige av enten heterologe ekspresjonssystemer eller dyrkede primære nevroner, kan verken som pålitelig reflektere mekanismer som spiller inn i voksen nevroner. Her rapporterer vi en tilnærming som bruker overflaten biotinylering å kvantitativt måle overflateproteinnivåer i akutte hjernen skiver avledet fra voksne gnagere. Ved hjelp av denne tilnærmingen, presenterer vi data som viser at musen striatal dopamin transporter internalizes raskt i resom reaksjon på phorbol ester-mediert protein kinase C (PKC) aktivering.

Protocol

Alle dyr håndtering og vev høsting ble utført i samsvar med retningslinjene fra University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care bruk Committee (IACUC), etter den godkjente protokollen # A1506 (Melikian, PI). Nødvendige løsninger Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) – Make fersk daglig 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2…

Representative Results

Den neuronal dopamin transportøren er internalisert i respons til aktivering av PKC i cellelinjer 16-20. Til tross for mange rapporter som viser PKC-indusert DAT overflate tap i en rekke cellelinjer og ekspresjonssystemer, har det vært vanskelig å få bekreftet dette funnet i dyrkede dopaminerge nevroner 21-23. Vi brukte mus striatum-skiver til direkte å teste om DAT internalizes som reaksjon på PKC aktivering hos voksne dopaminerge nevroner. Etter skive fremstilling, ble skiver hemisected lan…

Discussion

Til tross for lang erfaring som endocytic menneskehandel kritisk påvirker synaptiske signalering i hjernen, har det vist seg utfordrende å kvantitativt måle endringer i protein overflate uttrykk hos voksne nevroner. I dette arbeidet, rapporterer vi en pålitelig tilnærming til å merke overflateprotein ex vivo i akutte hjernen skiver. Brain slice forberedelser har en lang historie av verktøy for elektrofysiologiske opptak, som de opprettholder synaptiske forbindelser og celleviabilitet opptil timer etter t…

Materials

sulfo NHS-SS-biotin	Pierce	21331
Streptavidin agarose	Pierce	20347
IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin	Sigma	A3059
Vibrating microtome sectioner	Various
Shaking water bath	various
Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size)	Millipore	PI8P 012 50	These can be washed by hand and re-used