Her beskriver vi en protokol baseret på epigenetiske omprogrammering af humane embryonale stamceller (hESCs) retning af at skabe en homogen population af skeletmuskulaturen stamfædre, at der under tolerante dyrkningsbetingelser danner tredimensionelle klynger af kontraktile myofibre (myospheres), som rekapitulere biologiske funktioner i menneskets skelet muskler.
Generering af en homogen og rigelig population af skeletmuskelceller fra humane embryonale stamceller (hESCs) er et krav for cellebaserede behandlingsformer og for en "sygdom i en skål" model af menneskelige neuromuskulære sygdomme. Større forhindringer, såsom lav tæthed og heterogenitet af befolkningen i rente, samt en manglende protokoller for dannelsen af tre-dimensionelle kontraktile strukturer har begrænset anvendelser af stamceller til neuromuskulære lidelser. Vi har designet en protokol, der overvinder disse grænser ved ektopisk indførelse af definerede faktorer i hESCs – musklen beslutsomhed faktor MyoD og SWI / SNF kromatin remodellering kompleks komponent BAF60C – der er i stand til at omprogrammere hESCs i skeletmuskelceller. Her beskriver vi den protokol, etableret for at generere hESC-afledte myoblaster og fremme deres klyngedannelse i tredimensionale miniaturiserede strukturer (myospheres), som funktionelt efterligne miniaturiserede skeletmuskulatur 7 </sup>.
På grund af deres unikke evne til selv at forny og samtidig bevare pluripotency er de menneskelige embryonale stamceller (hESCs) betragtes som en uvurderlig ressource i regenerativ medicin. Stem cellemedieret repopulation af syge muskler og hESC-eller induceret pluripotente stamceller (IPSC)-afledt generation af skeletmuskulatur til in vitro sygdom modellering er centrale mål for undersøgelser med henblik på at identificere behandlinger, og belyse patogenesen af mange neuromuskulære sygdomme. Imidlertid har disse undersøgelser er blevet udfordret af modstanden af hESCs til at konvertere til skeletmuskelceller og ved mangel på oplysninger om den molekylære regulering af embryonale-engagement mod skelet myogenese. Faktisk tidligere forsøg på at generere skeletmuskulaturen stamfædre fra hESCs viste, at kun embryoid krop (EB)-afledte afkom eller mesenkymceller er kompetente til at aktivere skelet myogenese efter ektopisk udtryk for transskriptionsaktivatorer (f.eksPAX3 eller Myf5) 1-3 eller ved udsættelse for specifikke dyrkningsbetingelser 4-5.
Vi har tidligere vist, at SWI / SNF komponent BAF60C (kodet af SMARCD3), er en væsentlig bestanddel af det transkriptionelle maskineri, der gør det muligt MyoD-medieret aktivering af muskel-specifikke loci 6. Vi har for nylig opdaget, at en selektiv mangel på BAF60C giver på hESCs modstandsdygtigheden over for MyoD-medieret aktivering af skelet myogenese 7, der ellers er observeret i BAF60C udtrykker somatiske celler 8-10, en proces, der almindeligvis omtales som myogene konvertering. Tvunget udtryk for BAF60C giver MyoD til direkte at aktivere skelet myogenese i hESCs, på specifikke dyrkningsbetingelser, med BAF60C og MyoD pålægge en epigenetisk signatur, der forpligter hESCs mod myogenic afstamning 7. Notatet, tidligere proteom analyse afslørede selektiv mangel på BAF60C, blandt SWI / SNF komponenter i ESC 11.. Vi brugte denne viden til at pålægge en epigenetisk engagement hESCs på myogenic afstamning, der fører til dannelse af en homogen population af skeletmyoblaster der kunne aggregeres til at danne tredimensionale kontraktile strukturer (myospheres), der funktionelt efterligne miniaturiserede skeletmuskulatur 7. Faktisk vores metode til generering af skeletmuskulaturen stamfædre fra hESCs afhængig af epigenetiske engagement hESCs til myogenic afstamning, som er fænotypisk latent indtil cellerne udsættes for differentiering signaler, såsom celle sammenlægning og kultur i differentiering medium (se specifik protokol). Denne strategi tillader udvidelse af en homogen population af hESCs, der er epigenetisk forpligtet til skeletmuskulaturen afstamning og egnet til dannelse af tredimensionelle kontraktile myospheres der rekapitulere histologiske og funktionelle egenskaber af skeletmuskler. De myospheres giver de første beviser på miniaturiserede muskler udnyttes til en "sygdom i en skål" model af muskelsygdomme. Når der genereres fra patientens afledt iPSCs disse myospheres har potentiale til at belyse mangeårige udviklingsmæssige spørgsmål og patogenesen af sjældne sygdomme, ud over at tilbyde det enorme potentiale som et redskab til high throughput screening af terapeutiske forbindelser. Vi bemærker også, at en øjeblikkelig udlæsning af myosphere analyse kunne tilvejebringes ved immunhistokemi på strækninger, som er beskrevet i en JOVE protokol af Gomes et al. 12.
Den her foreslåede protokol beskriver, hvordan man generere tredimensionelle klynger af kontraktile myofibre (myospheres) direkte fra hESCs. Den foreslåede strategi har den hidtil usete og ekstraordinære potentiale for at producere mini muskler i suspension, der kan være egnet som en "sygdom i en skål" model for både screening assays og udviklingsmæssige undersøgelser. Desuden metode til at generere myospheres fra hESCs er ligetil og kræver ikke nogen FACS-sortering trin under differentiering, som typisk har en negativ indvirkning på udbyttet af udvundne celler. Desuden ville en sortering procedure under differentieringen interfererer med aggregering, da det indebærer en dissociation af EB i enkeltceller.
Den foreslåede metode er baseret på den epigenetiske reprograming af hESCs med specifikke faktorer, MyoD og BaAF60C, som ikke er udtrykt i pluripotente embryonale stamceller. MyoD og BAF60C give den "kerne" protein kompleks thpå mærker det genomiske loci, hvorfra transskription forløber at aktivere skelet myogene program. De to faktorer, der leveres til cellerne ved hjælp af lentivirale infektioner, og det er derfor afgørende for at opnå en høj effektivitet for infektion af begge faktorer i alle celler. Dette kan opnås ved hjælp af høj titer virus eller virus udstyret med selektionsmarkører. Dyrkningsbetingelser spiller også en vigtig rolle i at optimere omfanget af den myogene differentiering. Vi foreslår en serum differentiering protokol for differentieringen af MyoD/BAF60C udtrykke hESCs i klynger af myogene forstadier, efterfulgt af inkubation i serum-frit defineret medium (indeholdende insulin transferrin – ITS) for at opnå konvertering af myogene forstadier i skelet myotuber. Det er imidlertid muligt, at andre definerede medier kan opnå tilsvarende eller bedre myogene differentiering. En strømbegrænsning af protokollen er, at det bygger på anvendelsen af føtalt bovint serum, som ud over at indeholdening mange animalske proteiner og stoffer, viser parti-til-parti variationer. Dette kan resultere i lavere effektivitet eller heterogenitet myogenic konvertering inden myospheres. Notatet, ikke alle de EB-lignende strukturer, der stammer fra BAF60/MyoD-expressing hESCs er myospheres; nemlig nogle er EB-lignende aggregater fuldt sammensat af myofibre. Antallet af myospheres normalt fra hESCs udtrykker BAF60C og MyoD kan variere fra 30 til 60%, som anslået af immunfarvning på EB sektioner udføres ved afslutningen af protokollen (se resultater). En potentiel tilgang til at berige en kultur fad kun myospheres ville være at bruge en myogenic reporter. Dette vil gøre det lettere at kassere de delvist eller ikke differentierede EB-lignende klynger og vælge kun myospheres.
Endelig vil en bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund den tidsmæssige krav i de faktorer, der er indført være nyttigt at forbedre metoden til levering. For eksempel er hvis BAF60C og MyoD kræves kun til short tid til at "kick" cellerne i den rigtige retning, kunne blive anvendt metoder baseret på modificeret mRNA levering. Derimod, hvis der kræves faktorer for en længere tid, før cellerne udnytte deres endogene proteiner, et episomalt fremgangsmåde ville blive anbefalet at eliminere variabilitet og ukontrollerede virkninger på grund af integration i genomet. Endelig kan vi konstatere, at det er obligatorisk at udtrykke BAF60C før eller på samme tid som MyoD (aldrig efter) for at opnå embryonale konvertering til skelet muskler. Kravet om forudgående udtryk for BAF60C formentlig afhængig af sin rolle i pre-indstilling af epigenetiske landskab for korrekt MyoD kromatin distribution via genomet 6,15. Som sådan kunne fremtidige protokoller forbedres ved forbindelser eller andre manipulationer, der fremmer BAF60C udtryk i hESCs.
The authors have nothing to disclose.
PLP er en Associate investigator i Sanford Børns Health Research Center. Dette arbejde er blevet støttet af følgende tilskud til PLP: R01AR056712, R01AR052779 og P30 AR061303 fra National Institute of Health / National Institute of Arthritis og bevægeapparatet og hudsygdomme (NIAMS), MDA og Sanford Børn Health Research Award. Dette arbejde er delvist modtaget forskningsmidler fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram i projektet FP7-Health – 2009 ENDOSTEM 241.440 (Aktivering af vaskulatur tilhørende stamceller og muskel stamceller til reparation og vedligeholdelse af muskelvæv) SA blev støttet af. CIRM fællesskab.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |