Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.
Çoklu işlemleri mRNA ve proteinlerin transkripsiyon, çeviri ve stabilitesi de dahil olmak üzere gen ekspresyonu katılmaktadırlar. Bu adımların her biri sıkıca protein bolluğu nihai dinamiklerini etkileyen düzenlenir. Çeşitli düzenleyici mekanizmalar, tek başına gen ifadesinin güvenilir bir göstergesi mRNA seviyeleri veren, translasyon adımında bulunmaktadır. Buna ek olarak, mRNA çevirisinin düzenlenmesi yerel özellikle nörobiyolojisinde ilgi odağı 'translatomics' kayması, nöronal işlevleri implike edilmiştir. Sunulan bir yöntem köprü transkriptomik ve proteomics kullanılabilir.
Burada birden çok ribozomlara aktif tercüme mRNA'ların birlikte ve sukroz meyilleri içerisinde ayırıcı sedimantasyon göre translatome sorgular polyribosome paylarına ayırma tekniği için gerekli değişiklikleri açıklar. Geleneksel olarak, özellikle merkezindeki in vivo örnekleri, çalışmal sinir sistemi (CNS) nedeniyle malzemenin sınırlı miktarda ve yağ dokusu bileşenlerinin varlığı zor olduğu kanıtlanmıştır. Tek bir fare omurilik ve beyin kullanımı ile gösterildiği gibi, bu sorunu çözmek amacıyla, tarif edilen protokol, özellikle merkezi sinir sistemi materyalin minimum miktarda ile kullanım için optimize edilmiştir. Kısaca, CNS doku özü çıkarıldı ve çeviri ribozom sikloheksimid ile mRNA üzerinde immobilize edilir. Miyelin yüzdürme sonra lipid zengin bileşenleri kaldırmak için yapılır. Fraksiyonlama mRNA ribozomal kendi yüküne göre ayrılmış bir sükroz gradyanı üzerinde gerçekleştirilir. İzole edilmiş parçalar, yeni genom genişliğinde deney teknolojiler de dahil olmak üzere alt deneylerde, bir dizi için uygundur.
Gen ekspresyonu için, en büyük bir etki 1 açısı ile, transkripsiyon, çeviri ve mRNA ve proteinlerin stabilitesi birleşik etkisi ile belirlenir. Bu adımların her biri son derece düzenlenmiş olduğunu şimdi açıktır. Mikro-RNA'lar, RNA granül, alternatif ve sitoplazmik poliadenilasyonun oluşumu gen ifadesinin 2,3 post-transkripsiyonel düzenlenmesinde bazı örnekleridir. Bu mekanizmaların her biri çevirisinden transkripsiyon birbirinden ayrılacak ve ilgi duyulan biyolojik sistemde proteomesini etkilemektedir. Böylece, şaşırtıcı olmayan bir şekilde, yalnız mRNA düzeyleri protein düzeylerinin 4 kusurlu bir okuma vardır. Kantitatif proteomiks Ancak son gelişmelere rağmen, hassasiyet ve protein dizi çözünürlükte önemli sınırlamalar hala var, gen ifadesinin en doğrudan değerlendirmesini sağlar. Bu nedenle translatome adresleme, çeviri mRNAların repertuarı, eğitim arasında mükemmel bir denge sunuyortranscriptome ve proteomdaki. Bu nihai gen ifadesini değerlendirirken transkriptomik daha doğru ve daha yüksek kapsama alanı ve daha proteomikte dizisi çözünürlük hem de sağlar.
Memeli sistemlerde, çeviri olayların çoğu kapak bağımlı başlaması ile başlar. Birlikte 40S ribozomal küçük alt-birimi ile ökaryotik başlatma faktörleri bir grup bir mRNA'nın 5 'başlık ile birleşir. Kompleks, daha sonra mRNA tarar ve Ağustos başlangıç kodonu ulaştıktan sonra, tam bir 80S ribozom oluşturulması için 60S ribozomal alt birimini büyük işe. Uzama aşama ribozom uzama faktörleri, olgunlaşmamış peptid zincirine tRNA'ların yüklü amino asitlerin dahil edilmesi yardımcı ile, mRNA'nın boyunca hareket ile devam eder. Çoklu eş zamanlı olarak tek bir ribozomlar mRNA boyunca devam edebilir ve ilişkili ribozom sayısının protein sentezi 5,6 oranı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu ribozomal yükleme tran için güvenilir bir gösterge yaparslation ve aktif sedimantasyon dayalı mRNA'ları çeviri ayrılmasını sağlar. MRNA çeviri miktarının ilave olarak, sekans bilgileri için düzenlenmesinde rol oynayan motifleri tanımlamak için elde edilebilir. Ayrıca, bağlayıcı proteinler ve diğer faktörler için ilgili düzenleyici proteinlerin çalışma ve keşif kolaylaştıran farklı fraksiyonlarından izole edilebilir RNA.
Sinir sisteminde, translasyon kontrol mRNA depolama, taşıma ve yerel protein sentezi gibi işlemler ile bağlantılı olmuştur. Büyüme konileri akson 7 geri kalanından farklı mRNA belirli bir lokalize havuz liman gösterilmiştir. Buna ek olarak, lokal akson proteinlerin 8,9 sentezleme yeteneğine sahiptirler. Sonuç olarak, çeviri lokal kontrol nörobiyoloji çalışmanın önemli bir konu haline gelmiştir. Bu adrese polyribosome fraksiyonasyon potansiyel tekniği için kullanılan edildiği, çeşitli çalışmalarda gösterilmişomurilik gelişiminde akson rehberlik araştırmak ve beyin 10,11 BDNF aktivite bağımlı çeviri gösterdi.
Polyribosome fraksiyonasyon yeni bir teknik değildir, ancak, bu, özellikle zor bir kalır. Giriş maddesinin göre, önemli optimizasyonu gerekli olabilir. Bu, özellikle maddenin miktarı genellikle doku bileşenlerinin çeviri mRNA'ların izole engelleyen bir sınırlama ve yağlı olan in vivo CNS örnekleri, için de geçerlidir. En yayınlanan fraksiyon protokolleri maya veya memeli hücre hatları ile anlaşma ve beyin 12,13,14 için kurulan protokolleri vardır. Bunun aksine, omurilik fraksiyonasyon açıklayan yayınlar herhangi bir zorlukla vardır ve önceki protokol 15, toplanmış edilecek hayvan çok sayıda omurilik gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, birkaç temel modifikasyonlar tek bir fare omurilik dahil CNS dokular için fraksinasyon protokol uyum için yapılmıştır. Siklohekzimidsiz ile Ribozom immobilizasyon Durin ribozomların ayrılmasını önlemek için hayvan perfüzyon sırasında yapılırdoku çıkarma g uzun bir süreç. Daha sonra, RNA polysomal polyribosome verimini en üst düzeye çıkarmak için özel bir şekilde ekstre edilmiştir. İlk olarak, douncing ile doku homojenizasyon kontrol sağlam çekirdeği tutar ve DNA kirlenmesini önler. Çekirdeği, daha sonra santrifüjleme ile güvenilir bir şekilde uzaklaştırılır. NP-40 deterjan ve sodyum deoksikolat kombinasyonu, endoplazmik retikulum ve membran bağlantılı ribozom salım lizizine sağlar. Buna ek olarak, lipid açısından zengin olan miyelin UV emici bileşenler polyribosome profilleri gizleyebilir. Böyle poliribozomların gibi yoğun bileşikler topaklandı ve miyelin şamandıra gibi hafif bileşikler ve 16 kaldırılır nerede miyelin yüzdürme, bu nedenle gereklidir. Poliribozomların daha sonra 17.5% to 50% sukroz gradyanı üzerine çöktürülür. Yerine elle her sakaroz katman katman ve dondurma, geçişlerini de bir degrade mikser kullanarak hazırlanabilir. Asidik fenol / kloroform kullanılarak fraksiyonlardan RNA ekstraksiyonu sağlar: DNA az RNA kaybı ile kaldırılacak. Bununla birlikte, faz ters çevirme (fraksiyon 16 yukarıda) yoğun sükroz kısımların oluşabilir.
Bu protokol, çeviri düzeyini ele diğer geleneksel yöntemler üzerinde avantaj sağlamaktadır. Örneğin, fosforile S6 (önemli bir çeviri işaretleyici) ölçümü yanı sıra radyoizotop ile doğmakta zincirleri etiketleme hem küresel çeviri düzeyleri hakkında bilgi verir ama özellikle tercüme ediliyor ne az ortaya koymaktadır. Polyribosome fraksiyonasyon, diğer taraftan, değerlendirme küresel çeviri değil, aynı zamanda çeviri mRNA ve ilgili düzenleyici proteinlerin kimlik sağlar. Kantitatif gerçek zamanlı PCR seçilen mRNA'lanmn dışarı hızlı okuma için izole RNA'lar yapılabilir ve mikroarray'ler ve sonraki nesil dizileme RNA genom çalışmaları için yapılabilir. Burada sunulan, bu nedenle en iyi duruma azaltılması, bu teknik CNS dokuların minimal miktarda kullanılmasına izingerekli hayvan sayısını ing ve doku işlem süresini azaltarak genel deneysel kalitesinin artırılması. Öte yandan, bu teknik, çeviri olanlardan takılmış iken ribozomlar ayırt edemez. Durdu ribozomlar taşıyan transkript ağır kesirler çöktürmek edecek ve verileri yorumlayarak bu akılda tutulmalıdır.
Ribozom, bir hücre tipi özel bir şekilde, sırasıyla epitop etiketleri veya muhabir ile etiketlenmiş ve immüno-çökeltme ile izole edilmiş mRNA 17,18 ilişkili olan, son bildirilen teknikler, yani RiboTaq ve TRAP vardır. Bu teknik, özel hücre popülasyonları için okuma yüksek çözünürlük sunan fraksiyonasyon polyribosome akuple edilebilir. Ribozom ayak baskı ribozomlar tarafından korunmaktadır mRNA'lar başka bir yeni küçük fragmanları üretmek için nükleaz sindirimini içerir tekniği ya da "ayak izi" dir. Kütüphane daha sonra bu ayak oluşturulur ve dizilenmektedir. Bu yöntem, ataçeviri üzerine bir kodon-özel tüm genom analizi IDE ve durdu ribozomlar tespit etmek mümkün değildir, olmayan-Ağustos kodonları ve polyribosome fraksiyonasyonu 19 tarafından elde edilemeyen küçük memba açık okuma çerçeveleri, başlatın. Ancak, fraksiyonasyon polyribosome, böylece yüksek saflıkta örnek genellikle gerekli olduğu bir kütüphane hazırlanması için gerekli olan moleküler türler için zenginleştirici, bir ribozom içeren sindirilmiş fragmanlarının izole edilmesi için bir ribozom profil akuple edilebilir. Birlikte ele alındığında, polyribosome ayırma kalıcı öneme sahip esnek bir metot olup, yeni nesil genom sekanslama gibi deneyler dahil olmak üzere çeşitli alt uygulamalara akuple edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF), (Sistem Biyolojisi Helmholtz Alliance) Kanser sinyal ve sistemler Biyoloji ve Alman Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ) tarafından desteklenmiştir.
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |