الطباعة المغمورة من خلايا على سطح معدلة باستخدام التدفق المستمر Microspotter
Summary
This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.
Abstract
The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.
Introduction
وقد أدت التطورات الحديثة في مجال الصناعات الدوائية لزيادة الاهتمام باستخدام ميكروأرس الخلوية في عملية اكتشاف العقاقير لفحص المخدرات وتحليل cytotoxicological 1،2،3. ان تطوير في المختبر فحوصات عالية الإنتاجية وأساليب الفحص باستخدام ميكروأرس خلية تسهيل التنمية السريعة والفعالة من حيث التكلفة من المرشحين المخدرات فضلا عن تعزيز فهم الأساسية للخلية 1،4. النهج التقليدي لفحص مع الخلايا التقليدية يستخدم منصات جيدا لوحة؛ ولكن هذا النهج محدودة بسبب التكلفة العالية، الإنتاجية محدودة، وقدرة محدودة للحصول على معلومات كمية عن وظيفة الخلية 1،5. بسبب هذه القيود، والبحوث في مجال تكنولوجيات ميكروأري الخلوية المتزايد على التوصيف الجزيئي البيولوجي، هندسة الأنسجة، والفحص 1،6 المخدرات. وتشمل مزايا ميكروأرس الخلوية أصغر استخدام عينة، وآثار ضئيلة منالنمط الظاهري الخلوية التجانس اخفاء المعلومات، والأهم من ذلك القدرة على أتمتة المقايسات لمزيد من التطبيقات الإنتاجية العالية 1،7،8.
يستخدم حاليا صناعة الأدوية عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا فحوصات الفرز مع 2D الثقافات أحادي الطبقة خلية لفحص المخدرات في لوحات عيار مكروي جيدا 9. الخلايا المتنوعة في آبار وحات microtiter يوفر إمكانية إنتاجية أعلى مع خيارات التجريب فريدة من نوعها. علاوة على ذلك، التقنيات الحالية لميكروأرس الخلوية تسمح للخلايا لتجف الذي يمكن أن يغير بشكل كبير من النمط الظاهري للخلايا في الجسم الحي من 10،11. من أجل التغلب على هذه المشاكل، تم هندستها لMFCA ويظهر في الشكل 1. تصميم FLUIDICS MFCA 3D تمكن غيض رأس الطباعة في الشكل 1 أن يكون خفضت في حمام وضغطها على سطح على شكل خاتم. غيض السيليكون لينة من رأس الطباعة يتصرف مثلوتشكل طوقا ختم عكسها. هي مناسبة التكنولوجيا MFCA فريد على التفاعل مع الأسطح المغمورة، وهو مطلوب لكلا مزارع الخلايا والأنسجة أنظمة شريحة، ومن الصعب أو المستحيل مع معظم المناهج الأخرى. سوف دبابيس أو الطباعة بالحبر النفاث لا تعمل، وعدم تناسب الأجهزة ميكروفلويديك 2D لترسب أو التواصل مع صفائف كبيرة من بقع منفصلة. علاوة على ذلك، عن طريق التصغير وإضفاء الطابع المحلي على التجربة – ميكروأري الخلوية – وMFCA يتغلب على المشاكل الرئيسية المرتبطة عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا فحوصات الفرز.
يستخدم CFM شبكات قناة 3D لدورة صغيرة عينات السائل حجم البقعة على مواقع المجهرية على سطح 12،13. عن طريق طباعة مع التدفق، ويتم الاحتفاظ الجزيئات الحيوية، والخلايا، والكواشف الأخرى في البيئة السائلة في جميع مراحل عملية الطباعة، وتمكن من الطباعة من الجزيئات الحيوية الحساسة والخلايا دون التعرض للهواء، مما يعوق تقنيات الطباعة الخلية الحالية. ومن الممكن أيضا لطباعة مباشرة من المواد الخام مثل هجين أو supernatants المقدمة هناك آلية القبض على السطح مجموعة. الهدف من هذا المخطوط هو شرح بالتفصيل الطباعة المغمور من أنواع الخلايا اثنين على سطح.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكنولوجيا الطباعة 3D ميكروفلويديك الموصوفة هنا هو قادر فريد من صفائف الطباعة microfluidically من الخلايا في السائل شغلها جيدا، أي سطح المغمورة. عن طريق طباعة على الأسطح المغمورة، ميكروأرس الخلية يمكن أن تنتج التي تحافظ على النمط الظاهري الخلوية ذات الصلة من الناحية الف…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه كريس مورو للحصول على المساعدة الفنية. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة SBIR (R43) منح 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Continuous Flow Microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | cell media additive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | stain cell sfor counting |
| Haemocytometer | Fisher | 267110 | cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | used to remove cells from surface |
Referências
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. . Integrated Biochips for DNA Analysis. , (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
