הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה
Summary
This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.
Abstract
The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.
Introduction
ההתקדמות שחלה באחרונה בתעשיית התרופות הובילה לעניין מוגבר בבאמצעות מערכים הסלולר בתהליך גילוי תרופות להקרנת סמים 1,2,3 ניתוח cytotoxicological. ההתפתחות במבחני חוץ גופית תפוקה גבוהה ושיטות הקרנה באמצעות מערכי תא יקל על הפיתוח המהיר וחסכוני של מועמדי תרופה, כמו גם לקדם את ההבנה הבסיסית של התא 1,4. הגישה המסורתית להקרנה עם תאים משתמשת בפלטפורמות היטב צלחת קונבנציונלית; עם זאת גישה זו מוגבלת בשל העלות הגבוהה, תפוקה מוגבלת, והיכולת המוגבלת לקבלת מידע כמוני על 1,5 תפקוד תא. בשל המגבלות הללו, מחקר בטכנולוגיות microarray הסלולרי המתפתח לאפיון מולקולרי ביולוגי, הנדסת רקמות, ו1,6 הקרנת סמים. היתרונות של microarrays הסלולרי כוללים שימוש מדגם קטן יותר, לוואי מינימאלי שלההטרוגניות פנוטיפ הסלולרי מיסוך מידע, והכי חשוב היכולת למכן מבחני עבור יותר יישומי תפוקה גבוהה 1,7,8.
תעשיית התרופות כיום מנצלת מבחני מיון מבוסס תאי תפוקה גבוהה עם תרבויות monolayer תא 2D להקרנת סמים בצלחות גם microtiter 9. תאי ריבוב בבארות של צלחות microtiter מציעים את הפוטנציאל לתפוקה גבוהה יותר עם אפשרויות ניסויים ייחודיות. יתר על כן, בטכנולוגיות עדכניות לmicroarrays הסלולר לאפשר לתאים יבשים שיכול לשנות באופן דרמטי את הפנוטיפ של התאים מin vivo 10,11. כדי להתגבר על בעיות אלה, MFCA תוכנן ומוצגת באיור 1. העיצוב של fluidics MFCA 3D מאפשר את קצה ראש ההדפסה באיור 1 שהוריד לתוך אמבט ודחוס כנגד משטח כדי ליצור חותם. קצה סיליקון הרך של ראש ההדפסה מתנהג כמואטם ומהווה חותם הפיך. טכנולוגית MFCA מתאימה באופן ייחודי להתממשק עם משטחים מתחת למים, אשר נדרש עבור שניהם בתרביות תאים ומערכות פרוסה רקמה, וקשה או בלתי אפשרי עם רוב גישות אחרות. סיכות או הדפסת הזרקת הדיו לא תעבוד, ומכשירי microfluidic 2D אינם מתאימים להפקדה או התממשקות עם מערכים גדולים של נקודות בדידות. יתר על כן, על ידי miniaturizing והלוקליזציה של הניסוי – microarray הסלולרי – MFCA מתגבר על הבעיות העיקריות הקשורות למבחני מיון מבוסס תאי תפוקה גבוהה.
CFM משתמש ברשתות ערוץ 3D לדגימות נפח נוזל קטנות מחזור פני מקומות נקודה מיקרוסקופיים על משטח 12,13. על ידי הדפסה עם זרימה, ביומולקולות, תאים, וחומרים כימיים אחרים נשמרות בסביבה נוזלית לאורך כל תהליך ההדפסה, המאפשרות ההדפסה של ביומולקולות ותאים הרגישים ללא חשיפה לאוויר, אשר מעכב את טכניקות הדפסת התא הנוכחיות. כמו כן ניתן להדפיס ישירות מחומר גולמי כגון hybridoma או supernatants בתנאים שיש מנגנון לכידה על פני המערך. המטרה של כתב יד זה היא להסביר בפירוט את הדפוס השקוע של שני סוגי תאים על גבי משטח.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנולוגיית הדפסת microfluidic 3D שתוארה כאן היא מסוגל מערכי הדפסת microfluidically של תאים באופן ייחודי לנוזל מילא היטב, כלומר משטח מתחת למים. על ידי הדפסה על משטחים מתחת למים, ניתן לייצר microarrays התא, כי לשמור על הפנוטיפ רלוונטי מבחינה פיזיולוגית התאי של תאים, כמו גם את היכולת זמ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר כריס מורו לקבלת סיוע טכני. מימון ניתן על ידי NIH SBIR (R43) להעניק GRANT10940803 1R43GM101859-01 (MPI).
Materials
| Continuous Flow Microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | cell media additive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | stain cell sfor counting |
| Haemocytometer | Fisher | 267110 | cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | used to remove cells from surface |
Referências
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. . Integrated Biochips for DNA Analysis. , (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
