Den Submerged Utskrift av celler på en modifisert overflate ved hjelp av en kontinuerlig strømnings Microspotter
Summary
This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.
Abstract
The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.
Introduction
Nylige fremskritt innen den farmasøytiske industrien har ført til økt interesse for å bruke mobilnettet mikromatriser i drug discovery prosessen for narkotika screening og cytotoxicological analyse 1,2,3. Utviklingen av in vitro-high-throughput screening-analyser og fremgangsmåter som benytter celle mikromatriser vil lette rask og kostnadseffektive utviklingen av medikamentkandidater, så vel som på forhånd den grunnleggende forståelse av cellen 1,4. Den tradisjonelle tilnærmingen til screening med celler bruker konvensjonelle vel-plate plattformer; Men denne fremgangsmåten er begrenset på grunn av de høye kostnader, begrenset gjennomstrømning, og begrenset evne for kvantitativ informasjon om cellefunksjon 1,5. På grunn av disse begrensningene, er forskning i cellulær mikromatriseteknologi spirende for molekylær biologisk karakterisering, tissue engineering, og narkotika screening 1,6. Fordelene med cellulære mikromatriser omfatter mindre utvalg bruk, minimale effektercellulær fenotype heterogenitet maskeringsinformasjon, og viktigst muligheten til å automat analyser for mer høy gjennomstrømning 1,7,8.
Den farmasøytiske industrien i dag benytter high-throughput cellebasert screening-analyser med 2D-celle ettlagskulturer for narkotika screening i mikrptiterbrønn plater ni. Multiplexing celler i brønner av mikrotiterplater gir potensial for høyere gjennomstrømning med unike eksperimentering alternativer. Videre er de nåværende teknologier for cellulære mikromatriser tillate cellene å tørke noe som dramatisk kan endre fenotypen av cellene fra in vivo 10,11. For å overvinne disse problemer ble MFCA konstruert og er vist i figur 1.. Utformingen av MFCA 3D lufthåndtering muliggjør hodet spissen i figur 1 for å bli senket ned i et bad og komprimeres mot en overflate for å danne en tetning. Den myke silikonspissen av skrivehodet oppfører seg som enpakning og danner en reversibel tetning. Den MFCA teknologien er unikt tilpasset grensesnitt med neddykkede flater, som er nødvendig for både cellekulturer og vev slice systemer, og er vanskelig eller umulig med de fleste andre tilnærminger. Pins eller blekk jet utskrift vil ikke fungere, og 2D microfluidic enheter er ikke egnet for deponering eller grensesnitt med store matriser av diskrete flekker. Videre, ved miniaturizing og lokalisering av forsøket – det cellulære mikromatrise – den MFCA overvinner de hovedproblemer forbundet med high-throughput screening-celle-baserte analyser.
CFM bruker 3D-kanal nettverk for å sykle små volum væskeprøver enn mikroskopiske stikk steder på en flate 12,13. Ved å skrive ut med strømning, blir biomolekyler, celler og andre reagenser som opprettholdes i et flytende miljø i hele trykkeprosessen, slik at trykkingen av følsomme biomolekyler og celler uten eksponering for luft, noe som hindrer den aktuelle celle trykkteknikk. Det er også mulig å ut direkte fra råmaterialet slik som hybridom-supernatanter, eller forutsatt at det er en utløsermekanisme på matriseoverflaten. Formålet med dette manuskriptet er å forklare i detalj en neddykket trykking av to celletyper på en overflate.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D microfluidic utskriftsteknologi beskrevet her er unikt i stand til microfluidically utskrift matriser av celler i en væske fylt godt, dvs. en neddykket overflaten. Ved å skrive ut på neddykkede overflater, kan celle mikromatriser fremstilles som opprettholder det fysiologisk relevante cellulære fenotype av celler, så vel som evne til å multiplekse celler i bunnen av en enkelt brønn Figur 4. Resultatene av denne studien viser at microfluidically utskrift celler resulterer i celle vedle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Chris Morrow for teknisk assistanse. Finansieringen ble gitt av NIH SBIR (R43) gir 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Continuous Flow Microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | cell media additive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | stain cell sfor counting |
| Haemocytometer | Fisher | 267110 | cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | used to remove cells from surface |
Referências
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. . Integrated Biochips for DNA Analysis. , (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
