A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

Summary

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Abstract

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

Introduction

Os recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um interesse crescente no uso de microarranjos de celulares no processo de descoberta de medicamentos para a triagem de drogas e cytotoxicological ^1,2,3 análise. O desenvolvimento de ensaios in vitro de alto rendimento e métodos de rastreio utilizando microarrays de células facilitaria o desenvolvimento rápido e de baixo custo de candidatos da droga, bem como avanço a compreensão fundamental da célula ^1,4. A abordagem tradicional de triagem com células usa plataformas bem-placa convencionais; No entanto, esta abordagem é limitada devido ao custo elevado, o rendimento limitado, e uma capacidade limitada para fornecer informação quantitativa sobre a função das células ^{de 1,5.} Devido a essas limitações, a pesquisa em tecnologias de microarray celular é crescente para a caracterização molecular biológica, engenharia de tecidos, e droga triagem ^1,6. As vantagens de microarrays celulares incluem o uso de amostra menor, efeitos mínimos deheterogeneidade fenótipo celular mascarando informações, eo mais importante a capacidade de automatizar ensaios para mais aplicações de alto rendimento ^1,7,8.

A indústria farmacêutica utiliza atualmente de alto rendimento à base de células testes de rastreio com 2D culturas em monocamada de células para triagem de drogas em locais bem microplacas ^9. Células de multiplexagem em poços de placas de microtitulação oferece o potencial para um maior rendimento com opções de experimentação originais. Além disso, as actuais tecnologias de micromatrizes celulares permitem que as células para secar o que poderia alterar dramaticamente o fenótipo das células in vivo a partir de ^10,11. A fim de superar estes problemas, o MFCA foi concebido e é mostrado na Figura 1. O design dos fluidos MFCA 3D permite que a ponta da cabeça de impressão da Figura 1 a ser baixada para dentro de um banho e comprimida contra a superfície de modo a formar uma vedação. A ponta de silicone macio da cabeça de impressão se comporta como umjunta e forma uma vedação reversível. A tecnologia MFCA é adequada exclusivamente para fazer a interface com superfícies submersas, que é necessário para ambas as culturas de células e sistemas fatia do tecido, e é difícil ou impossível com a maioria das outras abordagens. Pinos ou impressão a jato de tinta não vai funcionar, e dispositivos microfluídicos 2D não são adequados para a deposição ou interface com grandes conjuntos de pontos discretos. Além disso, ao miniaturizar e localizando o experimento – microarray celular – o MFCA supera os principais problemas associados com a de alto rendimento à base de células de ensaios de rastreio.

O CFM utiliza redes de canais 3D para ciclo de pequenas amostras de fluido de volume mais localizações pontuais microscópicas em uma superfície de ^12,13. Ao imprimir com fluxo, biomoléculas, as células e os outros reagentes são mantidos em meio líquido durante todo o processo de impressão, permitindo a impressão de biomoléculas sensíveis e células, sem exposição ao ar, o que dificulta as técnicas de impressão de células actuais. É também possível imprimir directamente a partir de material em bruto, tais como sobrenadantes de hibridoma, ou, desde que exista um mecanismo de captura na superfície da matriz. O objetivo deste artigo é explicar em detalhes a impressão submersa de dois tipos de células em uma superfície.

Protocol

1. Célula Preparação Cultura Guarde os estoques celulares NIH/3T3 em nitrogênio líquido até que esteja pronto para uso. Preparar meio completo para células NIH/3T3 utilizando Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, tampão HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina. Descongelar as células para 2-3 min num banho de água com agitação a 37 ° C. Ressuspender as células em 5 ml de meio completo …

Representative Results

As células NIH/3T3 de linha de células de fibroblastos foram semeados em impressos ou uma superfície submersa. As células foram cultivadas a uma densidade de 5 X 10 4 culas por ml. As células foram semeadas utilizando técnicas de cultura de células tradicional. As células foram impressas utilizando uma grande formato, doze fluxo cabeçote célula, onde os canais são maiores (~ 500 mm) do que a utilizada para CFM proteínas e outras biomoléculas. As células foram semeadas ou impresso sobre uma super…

Discussion

A tecnologia de impressão 3D microfluídicos aqui descrito é o único capaz de matrizes de impressão microfluidically de células em um líquido bem cheio, ou seja, uma superfície submersa. Ao imprimir sobre as superfícies submersas, microarrays de célula pode ser produzida que manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante das células, bem como a capacidade para multiplexar as células no fundo de um único poço Figura 4. Os resultados deste estudo mostram que microfluidically i…

Materials

Continuous Flow Microspotter	Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	base media for cells
HEPES buffer	Invitrogen	15630-080	cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-070	cell media additive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen		cell media additive
Trypan blue	Invitrogen	15250-061	stain cell sfor counting
Haemocytometer	Fisher	267110	cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Used for collecting images
Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium)	Invitrogen	14040-133	rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	used to remove cells from surface