Подводная Печать клеток на модифицированной поверхности с помощью непрерывного потока Microspotter
Summary
This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.
Abstract
The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.
Introduction
Последние достижения в области фармацевтической промышленности, привели к увеличению интереса к помощи через сотовую микрочипов в процессе обнаружения наркотиков для скрининга лекарственных средств и cytotoxicological анализа 1,2,3. Развитие в пробирке высокой пропускной анализов и методов скрининга с использованием клеточных микрочипов будет способствовать быстрому и экономически эффективное развитие лекарств-кандидатов, а также продвижение фундаментальное понимание клетки 1,4. Традиционный подход к скрининга с клетками использует обычные платформы хорошо пластины; Однако этот подход ограничен из-за высокой стоимости, ограниченной пропускной способности, и ограниченной способности для количественной информации о функции клеток 1,5. Из-за этих ограничений, исследования в сотовой микрочипов является растущей для молекулярно-биологической характеристике, тканевой инженерии, и наркотики 1,6. Преимущества сотовых микрочипов включают меньшее использование выборки, минимальные эффектысотовой фенотип неоднородности маскировки информации, а главное возможность автоматизировать анализы для более высокой пропускной приложений 1,7,8.
Фармацевтическая промышленность в настоящее время использует высокой пропускной клеток на основе скрининговых исследований с 2D клеточный монослой культур для скрининга лекарственных средств в луночных микротитровальных 9. Мультиплексирования клетки в лунках микротитровальных планшетах предлагает потенциал для более высокой пропускной способности с уникальными вариантов экспериментирования. Кроме того, существующие технологии для сотовых микрочипов позволяют клеткам, чтобы высушить который может резко изменить фенотип клеток в естественных условиях от 10,11. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, был разработан MFCA и показан на рисунке 1. Конструкция MFCA 3D струйной позволяет наконечник печатающей головки на рисунке 1, чтобы быть снижены в ванну и сжатый к поверхности, чтобы сформировать уплотнение. Мягкий силиконовый наконечник печатающей головки ведет себя какпрокладка и образует обратимые уплотнение. Технология MFCA однозначно подходит для взаимодействия с подводных поверхностей, где требуется как для клеточных культур и тканей срезов систем, и трудно или невозможно с большинством других подходов. Штыри или струйная печать не будет работать, и 2D микрожидкостных устройств не подходят для осаждения или взаимодействия с большими массивами дискретных пятен. Кроме того, по миниатюризации и локализации эксперимент – сотовый микрочипов – MFCA преодолевает основные проблемы, связанные с высокой пропускной основе клеток скрининга.
CFM использует 3D каналов сети для цикла образцов малого объема жидкости более микроскопических местах пятно на поверхности 12,13. Печатая с потоком, биомолекулы, клетки, и другие реагенты ведутся в жидкой среде на протяжении всего процесса печати, что позволяет печатать чувствительных биомолекул и клеток без воздействия воздуха, что препятствует текущие методов печати клеток. Кроме того, можно печатать непосредственно из сырого материала, такого как гибридомы или супернатантов при наличии механизм захвата на поверхности массива. Цель этой рукописи подробно объяснить погруженную печать двух типов клеток на поверхности.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D микрофлюидных технология печати, описанный здесь, однозначно способны microfluidically печати массивов клеток в жидкости заполнены хорошо, то есть погруженный поверхность. К печати на подводных поверхностей, сотовые микрочипы могут быть получены, что поддержание физиологически соотв?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Крис Морроу для оказания технической помощи. Финансирование было предоставлено NIH SBIR (R43) предоставить 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Continuous Flow Microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | cell media additive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | stain cell sfor counting |
| Haemocytometer | Fisher | 267110 | cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | used to remove cells from surface |
Referências
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. . Integrated Biochips for DNA Analysis. , (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
