In vivo billeddannelse af Optic Nerve Fiber Integritet ved kontrast-forstærket MRI i mus

Summary

Denne video illustrerer en metode, ved hjælp af en klinisk 3 T scanner til kontrast-forstærkede MR scanning af det naive mus visuel projektion og til gentagne og langsgående in vivo studier af synsnerven degeneration er forbundet med akut synsnerven crush skade og kronisk synsnerven degeneration i knock-out mus (p50 ^KO).

Abstract

Det gnaver visuelle system omfatter retina-ganglieceller og deres axoner, der danner synsnerven at indtaste thalamiske og midthjernen centre, og postsynaptiske projektioner til den visuelle cortex. Baseret på sin særegne anatomiske struktur og praktisk tilgængelighed, er det blevet den foretrukne struktur for undersøgelser af neuronal overlevelse, axonal regeneration, og synaptisk plasticitet. Nylige fremskridt i MR-scanning har aktiveret in vivo visualisering af Retino-tectal del af denne fremskrivning ved hjælp af mangan medieret kontrast enhancement (MEMRI). Her præsenterer vi en MEMRI protokol til illustration af den visuelle projektion i mus, hvorved resolutioner (200 pm) ³ kan opnås ved hjælp af fælles 3 Tesla scannere. Vi viser, hvordan intravitreal injektion af en enkelt dosis på 15 nmol _MnCl2 fører til en mættet forbedring af det intakte fremspring inden for 24 timer. Med undtagelse af nethinden, indregnes ændringer i signal intensitet uafdent af sammenfaldende visuel stimulation eller fysiologisk aldring. Vi mener desuden anvende denne teknik til langsgående overvåge aksonal degeneration i respons på akut synsnerven skade, et paradigme, som Mn ^{2 +} transport helt anholdelser på læsion site. Omvendt aktiv Mn ^{2 +} transport er kvantitativt i forhold til levedygtighed, nummer og elektriske aktivitet i Axon fibre. For en sådan analyse, vi eksemplificere Mn ^{2 +} transport kinetik langs den visuelle vej i en transgen musemodel (NF-KB-p50 ^KO) viser spontan atrofi af sensoriske, herunder visuelle projektioner. I disse mus MEMRI indikerer, reduceret, men ikke forsinket Mn ^{2 +} transport i forhold til vildtype-mus, og dermed afslører tegn på strukturelle og / eller funktionelle svækkelser af NF-KB-mutationer.

Sammenfattende MEMRI bekvemt bro in vivo-analyser og efter slagtning histologi for characterizatipå nerve fiber integritet og aktivitet. Det er meget nyttigt for longitudinelle studier på axonal degeneration og regeneration, og undersøgelser af mutant mus for ægte eller inducerbare fænotyper.

Introduction

Baseret på sin gunstige neuro-anatomiske struktur gnaver visuelle system giver enestående muligheder for at vurdere farmakologiske forbindelser og deres evne til at mægle neuroprotection ¹ eller pro-regenererende effekter ^2,3. Desuden giver det undersøgelser af de funktionelle og neuro-anatomiske karakteristika af mus mutanter, som for nylig eksemplificeret for mus mangler den præsynaptiske stilladser protein Fagot ^4.. Desuden et bredt spektrum af supplerende værktøjer giver ekstra featuring af retinal ganglion celle (RGC) og RGC Axon-numre samt RGC aktivitet, f.eks, ved elektroretinografi og adfærdsmæssige test, samt bestemmelse af kortikale omrokeringer af optisk billeddannelse af iboende signaler. Den seneste tekniske udvikling i laser mikroskopi aktivere in situ visualisering af RGC regenerering af dyb væv fluorescens billeddannelse i hele mount eksemplarer af synsnerven (ON) og hjerne. I denne histologiCal tilgang, tetrahydrofuran baseret væv clearing i kombination med lys ark fluorescensmikroskopi tillader opløsning af enkelte fibre, genindtræde i deafferented ON og optisk tarmkanalen ^5.. Mens sådanne teknikker kan være overlegen i opløsning og bestemmelse af vækstmønstre, de ikke gør det muligt gentagne og langsgående analyser af individuelle vækst begivenheder, som er særligt ønskede at vurdere processen for langsigtede regenerering.

Kontrast-forstærket MRI har været ansat i den minimale invasive visualisering af Retino-tectal projektion i mus og rotter ^6,7. Dette kan opnås ved direkte intraokulært levering af paramagnetiske ioner (fx ^{Mn2 +)} til retinale celler. Som et calcium analog, er Mn ^{2 +} indarbejdet i RGC somata via spændingsafhængige calcium kanaler og aktivt transporteres langs axonale cytoskeleton af det intakte ON og optisk tarmkanalen. Mens det ophobes i hjernekerneraf visuel projektion, dvs laterale geniculate nucleus (LGN) og overlegen colliculus (SC), transsynaptisk formering ind i den primære visuelle cortex vises ubetydelig ^8,9, selv om det kan forekomme ^10,11. Under MR sekventering, paramagnetiske Mn ^{2 +} øger MR kontrast hovedsageligt ved at forkorte T ₁ spin-gitter afslapning tid ^12. Sådanne Mn ^{2 +} forstærket MRI (MEMRI) er blevet anvendt med succes i forskellige neuro-anatomiske og funktionelle studier af rotter, herunder vurdering af axonal regenerering og degeneration efter ON skade ^13,14, den præcise anatomiske kortlægning af Retino-tectal projektion ¹⁵ samt bestemmelse af axonale transport egenskaber efter farmakologisk behandling ^16. Nylige forbedringer i dosering, toksicitet og kinetik af neuronale Mn ^{2 +} optagelse og transport, samt forbedrede MR-protokoller har udvidet sin ansøgning til undersøgelser af transgenemus ⁹ ved hjælp af 3 Tesla scannere, der almindeligvis anvendes i klinisk praksis ^17..

Her præsenterer vi en MEMRI protokol egnet til langsgående in vivo billeddannelse af muse Retino-tectal projektion og eksemplificere dets anvendelighed ved at vurdere Mn ^{2 +} afhængig signal enhancement under naive og forskellige neurodegeneration forhold. Vores protokol lægger særlig vægt på erhvervelse MR data i et moderat 3 T magnetfelt, der generelt er mere tilgængeligt end dedikerede dyre scannere. I naive mus, vi illustrere, hvordan tarmkanalen-specifikke signal intensitet kan være væsentligt og reproducerbart blive forøget efter intravitreal (ivit) Mn ^{2 +} ansøgning. Kvantitativt, Mn ^{2 +} udbredelse langs den visuelle projektion sker uafhængigt af den normale aldringsproces (målt mellem 3 og 26 måneder gamle mus) og augmentation er refraktær over for visuel stimulation og tilpasning til mørket. I modsætning hertil, Mn <sop> 2 + berigelse i thalamus og midthjernen centre er formindsket efter akut ON knusningsskade ¹⁸ samt i nfkb1 knock-out mus (P50 ^KO), der lider af spontan apoptotisk RGC død og ON degeneration ^19.. Således i udvidelse til konventionel histologisk analyse, langsgående MEMRI analyse af de enkelte dyr muliggør profilering af unikke kinetik af neurodegenerative processer. Dette skulle vise sig nyttigt for undersøgelser af neurobeskyttelse og axonal regenerering er forbundet med farmakologiske eller genetiske indgreb.

Protocol

Alle animalske indgreb udføres i overensstemmelse med den europæiske konvention til Animal Care og brugen af forsøgsdyr og ARVO erklæring til brug af dyr i Ophthalmic og Vision Research. Alle forsøg er godkendt af den lokale etiske komité. Proceduren for ON skade i mus er beskrevet andetsteds 9. 1.. Intravitreale Mangan Injection Udfør Mn 2 + indsprøjtning 24 timer forud for MR-scanning ved hjælp af en assistent. Bedøve dyrene ved …

Representative Results

Evne denne billeddannelse teknik til præcist at vurdere den vitalitet og funktionaliteten af den visuelle projektion afhængig præcise anvendelse af en ugiftig Mn 2 + dosering til glaslegeme og dets optagelse i rGCS. Denne store antagelse er testet i figur 1, hvor lag specifik Mn2 +-optagelse er påvist ved autometallografi (TIMM farvning) 21. Retina snit blev analyseret ved 24 timer efter ivit anvendelse af enten 15 nmol eller 150 nmol Mn2 +, eller…

Discussion

MEMRI af det visuelle system udvider konventionelle neurobiologiske teknikker til vurdering af funktionalitet under naive og patologiske tilstande. Bortset fra at levere et unikt indblik i integriteten af en isoleret CNS fiber-tarmkanalen, kan MEMRI let suppleres med adfærdsmæssige test, fx optometri og visuelt baserede vand opgaver, til at undersøge de umiddelbare konsekvenser af en given paradigme for visuel perception. Det forbinder også elektrofysiologiske og histologiske undersøgelser med funktionel v…

Materials

Manganese (II) chloride solution 1M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Isoflurane	Actavis, Munich, Germany	PZN 7253744
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G  needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908