In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse
Summary
Dieses Video zeigt ein Verfahren, mit einem klinischen 3 T Scanner, für kontrastverstärkte MR-Bildgebung des naiven Maus visuelle Projektion und für sich wiederholende und Längs in-vivo-Studien der Sehnerv-Degeneration mit akuter Sehnerven Quetschverletzung und chronische Degeneration des Sehnervs an assoziierten Knock-out-Mäusen (p50 KO).
Abstract
Das Nagetier visuelle System umfasst retinalen Ganglienzellen und ihre Axone, die den Sehnerv bilden Thalamus und im Mittelhirn Zentren und postsynaptischen Vorsprünge auf den visuellen Kortex ein. Auf der Grundlage seiner ausgeprägten anatomischen Struktur und bequeme Erreichbarkeit, hat es sich die bevorzugte Struktur für Studien über die neuronale Überleben, axonalen Regeneration und synaptische Plastizität. Jüngste Fortschritte in der MR-Bildgebung haben die in vivo Visualisierung des retino-tectalen Teil dieser Projektion mit Mangan-vermittelten Kontrastverbesserung (MEMRI) aktiviert. Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll für die Darstellung der visuellen Projektion in Mäusen, durch die Beschlüsse der (200 um) 3 lassen sich mit üblichen 3-Tesla-Scanner erreicht werden. Wir zeigen, wie intravitreale Injektion einer einzelnen Dosis von 15 nmol MnCl 2 führt zu einer Verbesserung der gesättigten intakt Vorsprung innerhalb von 24 Stunden. Mit Ausnahme der Netzhaut, Änderungen in der Signalstärke sind unabdent von übereinstimm visuelle Stimulation oder physiologische Alterung. Haben wir weiter diese Technik anzuwenden längs überwachen axonalen Degeneration in Reaktion auf akute Verletzung des Sehnervs ein Paradigmen durch die Mn 2 +-Transport vollständig Verhaftungen an der Verletzungsstelle. Umgekehrt ist aktiv Mn 2 +-Transport quantitativ angemessenen Verhältnis zur Rentabilität, Anzahl und elektrische Aktivität der Axon-Fasern. Für eine solche Analyse, veranschaulichen wir Mn 2 +-Transport Kinetik entlang der visuellen Pfad in einem transgenen Mausmodell (NF-kappaB p50 KO) Anzeige spontane Atrophie der sensorischen, visuelle, Projektionen. Bei diesen Mäusen zeigt MEMRI reduziert, sondern Mn 2 +-Transport im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nicht verzögert und zeugen somit Anzeichen für strukturelle und / oder funktionelle Beeinträchtigungen durch NF-kB-Mutationen.
Zusammenfassend MEMRI bequem überbrückt in vivo-Tests und Post-mortem-Histologie für die characterizatiauf der Nervenfaserintegrität und Aktivität. Es ist sehr nützlich für Längsschnittstudien zur axonalen Degeneration und Regeneration, und Untersuchungen von mutierten Mäusen für echte oder induzierbare Phänotypen.
Introduction
Aufgrund seiner günstigen neuro-anatomische Struktur das Nagetier visuelle System bietet einzigartige Möglichkeiten, pharmakologische Verbindungen und deren Eignung zur Neuroprotektion 1 oder pro-regenerative Wirkung 2,3 vermitteln. Darüber hinaus ermöglicht es Studien über die funktionalen und neuroanatomischen Merkmale von Mausmutanten, wie kürzlich für die Mäuse, denen der präsynaptischen Gerüstprotein Bassoon 4 veranschaulicht. Ferner ist ein breites Spektrum von Zusatzwerkzeugen bietet zusätzliche mit der retinalen Ganglienzellen (RGC) und RGC-Axone Nummern RGC-Aktivität, z. B. durch Elektroretinographie und Verhaltenstests und der Bestimmung der kortikalen Umlagerungen durch optische Abbildung der intrinsischen Signalen. Die neuesten technischen Entwicklungen in der Laser-Mikroskopie ermöglicht die in situ-Visualisierung von RGC Regeneration durch tiefe Gewebe Fluoreszenz-Imaging in ganze Berg Exemplare der Sehnerv (ON) und Gehirn. In dieser histologischenschen Ansatz, Tetrahydrofuran basierte Gewebe Clearing in Kombination mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Auflösung von Einzelfasern, die in die deafferentierten ON und Tractus 5 erneut eingeben. Während solche Techniken vielleicht überlegen in der Auflösung und Bestimmung von Wachstumsmustern zu sein, haben sie nicht aktivieren wiederholende und Längsschnittanalysen der einzelnen Wachstums Ereignisse, die besonders erwünscht sind, den Prozess der langfristige Regeneration zu beurteilen.
Kontrastmittel-MRT ist für die minimal invasive Visualisierung der retino tectalen-Projektion bei Mäusen und Ratten 6,7 eingesetzt. Dies kann durch direkte intraokulare Lieferung von paramagnetischen Ionen (z. B. Mn 2 +), um Netzhautzellen erreicht werden. Als Calcium-analog, wird Mn 2 + in RGC Somata über spannungsgesteuerte Calcium-Kanäle eingebaut und entlang der axonalen Zytoskeletts der intakten ON und Tractus aktiv transportiert. Während es in der Hirnkerne sammeltder visuellen Vorsprung, dh die Corpus geniculatum laterale (LGN) und Colliculus superior (SC), transsynaptische Ausbreitung in den primären visuellen Kortex erscheint vernachlässigbar 8,9, obwohl es 10,11 auftreten. Unter MR-Sequenzierung, paramagnetische Mn 2 + steigert MR-Kontrast hauptsächlich durch Verkürzen T1-Spin-Gitter-Relaxationszeit 12. Solche Mn 2 + MRT (MEMRI) ist erfolgreich in verschiedenen neuro-anatomische und funktionelle Untersuchungen von Ratten, wie die Bewertung des axonalen Regeneration und Degeneration nach ON Verletzungen 13,14 angewendet, die genaue anatomische Zuordnung der retino-tectalen Vorsprung 15 sowie die Bestimmung des axonalen Transporteigenschaften nach pharmakologischen Behandlung 16. Letzte Verfeinerungen in der Dosierung, Toxizität, und die Kinetik der neuronalen Mn 2 +-Aufnahme und Transport, sowie verbesserte MRI-Protokolle seiner Anwendung auf Studien an transgenen verlängertMäuse 9 mit 3-Tesla-Scanner üblicherweise in der klinischen Praxis 17 verwendet.
Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll eignet sich für Längs-in-vivo-Bildgebung der Maus retino tectalen-Projektion und veranschaulichen ihre Anwendbarkeit durch die Beurteilung Mn 2 +-abhängige Signalverstärkung unter naiv und Neurodegeneration verschiedenen Bedingungen. Unser Protokoll legt besondere Betonung auf der MR-Datenerfassung in einem moderaten 3 T Magnetfeld, die allgemein zugänglicher als engagierten Tier-Scanner. In naiven Mäusen veranschaulichen wir, wie Trakt spezifische Signalintensität erhöht werden, nach intravitrealer (ivit) Mn 2 +-Anwendung deutlich und reproduzierbar zu werden. Quantitativ, Mn 2 + Ausbreitung entlang der visuelle Projektion erfolgt unabhängig von den normalen Alterungsprozess (zwischen 3 und 26 Monate alten Mäusen gemessen) und Vergrößerung ist refraktär visuelle Stimulation und die Anpassung an Dunkelheit. Im Gegensatz dazu, Mn <sbis> 2 +-Anreicherung in Mittelhirn und Thalamus-Zentren wird nach akuter ON Quetschverletzung 18 sowie in NFKB1 Knock-out-Mäusen (p50 KO) leiden spontane RGC apoptotischen Tod und ON-Degeneration 19 verringert. So wird in Erweiterung zu herkömmlichen histologischen Analyse Längs MEMRI Analyse der einzelnen Tiere ermöglicht Profilierung der einzigartigen Kinetik von neurodegenerativen Prozessen. Dies sollte nützlich für Studien zur Neuroprotektion und axonalen Regeneration mit pharmakologische oder genetische Eingriffe verbunden beweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEMRI des visuellen Systems erstreckt herkömmlichen neurobiologische Techniken zur Beurteilung der Funktionalität unter naiven und pathologischen Bedingungen. Neben der einzigartigen Einblick in die Integrität eines isolierten ZNS-Fasertraktes, können MEMRI leicht mit Verhaltenstests, z. B., Optometrie und visuell basierte Wasser Aufgaben ergänzt werden, um die unmittelbaren Folgen eines bestimmten Paradigma für die visuelle Wahrnehmung zu untersuchen. Es verbindet auch elektrophysiologische und histologi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AK wird von der Oppenheim-Stiftung und RH unterstützt wird von der Velux-Stiftung. Wir danken I. Krumbein für technische und K. Buder für histologische Unterstützung, und J. Goldschmidt (Leibniz-Institut für Neurobiologie, Magdeburg, Deutschland) für technische Beratung bezüglich TIMM Färbung.
Materials
| Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
| Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
| Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
| Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
| 34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
| Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| Mouse holder | custom made | ||
| Red light lamp | |||
| Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
| Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
| Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 | |
Referências
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