In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi
Summary
Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 KO).
Abstract
Il sistema visivo roditore comprende cellule gangliari della retina e dei loro assoni che formano il nervo ottico per entrare nei centri talamo e mesencefalo, e proiezioni postsinaptici alla corteccia visiva. Sulla base della sua struttura anatomica distinta e comoda accessibilità, è diventato la struttura preferita per gli studi sulla sopravvivenza neuronale, rigenerazione assonale, e la plasticità sinaptica. Recenti progressi in RM hanno permesso la visualizzazione in vivo della parte retino-tectal di questa proiezione utilizzando manganese mediata aumento del contrasto (MEMRI). Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI per l'illustrazione della proiezione visiva nei topi, da cui risoluzioni (200 micron) 3 possono essere raggiunti utilizzando comuni 3 scanner Tesla. Dimostriamo come l'iniezione intravitreale di una singola dose di 15 nmol MnCl 2 porta ad un miglioramento saturo della proiezione intatto entro 24 ore. Con eccezione della retina, cambiamenti di intensità del segnale sono indisidente della coincisa stimolazione visiva o invecchiamento fisiologico. Applichiamo ulteriormente questa tecnica per monitorare longitudinalmente degenerazione assonale in risposta al danno del nervo ottico acuto, un paradigma con il quale Mn 2 + trasporto completamente arresti presso il sito di lesione. Al contrario, attivo Mn 2 + trasporto è quantitativamente proporzionale alla vitalità, il numero e l'attività elettrica delle fibre assoni. Per tale analisi, rappresentiamo Mn 2 + cinetiche di trasporto lungo il percorso visivo in un modello di topo transgenico (NF-kB p50 KO) visualizzando atrofia spontanea di sensoriali, tra cui visivi, proiezioni. In questi topi, MEMRI indica ridotta ma non ritardato Mn 2 + trasporto rispetto ai topi wild type, rivelando così segni di alterazioni strutturali e / o funzionali da mutazioni NF-KB.
In sintesi, MEMRI ponti comodamente in vivo e post mortem istologia per il characterizatisu integrità e l'attività delle fibre nervose. E 'molto utile per studi longitudinali sulla degenerazione assonale e rigenerazione, e ricerche di topi mutanti per fenotipi originali o inducibili.
Introduction
Sulla base della sua struttura neuro-anatomica favorevole il sistema visivo roditore offre possibilità uniche per valutare composti farmacologici e la loro capacità di mediare neuroprotezione 1 o effetti pro-rigenerativi 2,3. Inoltre, per studi sulle caratteristiche funzionali e neuro-anatomica di mutanti di topo, come recentemente esemplificato per topi privi della proteina ponteggio presinaptica Bassoon 4. Inoltre, un ampio spettro di strumenti supplementari permette supplementare con delle cellule gangliari retiniche (RGC) e numeri assoni RGC nonché attività RGC, ad esempio, da elettroretinografia e test comportamentali, e la determinazione di riarrangiamenti corticali mediante imaging ottico di segnali intrinseci. Gli ultimi sviluppi tecnici in microscopia laser consentono di visualizzazione situ di RGC rigenerazione profonda dei tessuti imaging di fluorescenza in interi esemplari di montaggio delle nervo ottico (ON) e il cervello. In questo histologapproccio iCal, tetraidrofurano basato radura del tessuto in combinazione con foglio leggero microscopia a fluorescenza permette la risoluzione delle singole fibre che ri-entrare nel deafferented ON e tratto ottico 5. Mentre tali tecniche possono essere superiori in risoluzione e determinazione della curva di crescita, non consentono analisi ripetitive e longitudinali di eventi di crescita individuali, particolarmente desiderati per valutare il processo di rigenerazione lungo termine.
Contrasto-enhanced MRI è stata impiegata per la visualizzazione minima invasività della proiezione retino-tectal in topi e ratti 6,7. Ciò può essere ottenuto mediante consegna intraoculare diretta di ioni paramagnetici (ad esempio, Mn 2 +) di cellule retiniche. Come un analogo calcio, Mn 2 + è incorporato in RGC somata tramite i canali del calcio voltaggio-dipendenti e attivamente trasportati lungo il citoscheletro assonale della ON intatta e tratto ottico. Mentre si accumula nei nuclei cerebralidella proiezione visiva, cioè il nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore (SC), la propagazione transsynaptic nella corteccia visiva primaria appare trascurabile 8,9, anche se può verificarsi 10,11. Sotto MR sequenziamento, paramagnetica Mn 2 + Potenziati MR contrasto principalmente accorciando T 1 spin-reticolo tempo di rilassamento 12. Tale Mn 2 + migliorato MRI (MEMRI) è stato applicato con successo in diversi studi neuro-anatomici e funzionali di ratti, compresa la valutazione della rigenerazione assonale e la degenerazione dopo sul pregiudizio 13,14, la precisa mappatura anatomica della proiezione 15 retino-tectal , nonché la determinazione delle caratteristiche trasporto assonale dopo il trattamento farmacologico 16. Recenti ricerche nel dosaggio, tossicità, e la cinetica dei protocolli MRI neuronali Mn 2 + assorbimento e il trasporto, nonché il miglioramento hanno esteso la sua applicazione agli studi sui transgenicitopi 9 con 3 scanner Tesla comunemente utilizzati nella pratica clinica 17.
Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI adatto longitudinale imaging in vivo del mouse retino-tectal proiezione ed esemplificare la sua applicabilità valutando Mn 2 + dipendente potenziamento del segnale in condizioni di neurodegenerazione ingenue e vari. Il nostro protocollo pone particolare enfasi sulla acquisizione dati MR in un moderato 3 T campo magnetico che è generalmente più accessibile rispetto agli scanner di animali dedicati. Nei topi naive, illustriamo come intensità di segnale specifico tratto può essere sostanzialmente e riproducibile diventare aumentata dopo intravitreale (ivit) Mn 2 + applicazione. Quantitativamente, Mn 2 + propagazione lungo la proiezione visiva si verifica indipendentemente dal normale processo di invecchiamento (misurata tra 3 e 26 mesi di età topi) e aumento è refrattario alla stimolazione visiva e l'adattamento all'oscurità. Al contrario, Mn <sup> 2 + arricchimento nei centri talamo e mesencefalo è diminuita a seguito acuta ON lesione da schiacciamento 18, così come in NFKB1 topi knock-out (p50 KO) affetti da spontanea morte apoptotica RGC e sulla degenerazione 19. Così, in espansione per analisi istologica convenzionale, longitudinale analisi MEMRI singoli animali ha la profilatura della cinetica uniche di processi neurodegenerativi. Questo dovrebbe rivelarsi utile per gli studi sulla neuroprotezione e rigenerazione assonale associati a interventi farmacologici o genetici.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEMRI del sistema visivo si estende tecniche neurobiologiche convenzionali per valutare la funzionalità in condizioni ingenue e patologiche. Oltre ad una visione unica l'integrità di un isolato fibra tratto CNS, MEMRI può essere facilmente integrato con test comportamentali, per esempio, optometria e compiti a base di acqua visivamente, di indagare le conseguenze immediate di un dato paradigma per la percezione visiva. Si collega anche elettrofisiologici e le indagini istologiche con caratterizzazione vi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AK è sostenuta dalla Fondazione Oppenheim e RH è supportato dalla Fondazione Velux. Ringraziamo I. Krumbein per Buder tecnica e K. per il sostegno istologico, e J. Goldschmidt (Istituto Leibniz di Neurobiologia, Magdeburgo, Germania) per un parere tecnico su TIMM colorazione.
Materials
| Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
| Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
| Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
| Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
| 34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
| Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| Mouse holder | custom made | ||
| Red light lamp | |||
| Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
| Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
| Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 | |
Referências
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