В естественных изображений зрительного нерва волокна целостность контрастным усилением МРТ у мышей
Summary
Это видео иллюстрирует способ, с помощью клинического 3 T сканера, для контрастированием МР томографии наивным мыши визуальной проекции и для повторяющихся и продольных естественных условиях исследования в зрительного нерва дегенерации, связанных с острым повреждением зрительного нерва на раздавливание и хронической дегенерации зрительного нерва в нокаут-мышей (р50 КО).
Abstract
Грызун визуальная система охватывает ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, которые формируют зрительный нерв, чтобы войти таламическое и среднего мозга центры и постсинаптические прогнозы на зрительной коре. На основе своего специфического анатомического строения и удобной доступности, он стал излюбленным структура исследований по выживаемости нейронов, регенерации аксонов и синаптической пластичности. Последние достижения в области МРТ позволили визуализации в естественных условиях ретинобластому tectal части этой проекции с использованием марганца опосредованной повышение контрастности (MEMRI). Здесь мы приводим протокол MEMRI для иллюстрации визуальной проекции у мышей, которым резолюции (200 мкм) 3 может быть достигнуто с помощью обычных 3 Tesla сканеры. Мы показываем, как инъекция из одного дозировке 15 нмоль MnCl 2 приводит к насыщенному повышения неповрежденной проекции в 24 час. За исключением сетчатки, изменения в интенсивности сигнала не зависятвмятина от совпадали визуальной стимуляции или физиологического старения. Кроме того, мы применить эту технику для продольно контролировать дегенерацию аксонов в ответ на острый зрительного повреждения нерва, парадигма, по которому Mn 2 + транспорт полностью аресты на месте повреждения. С другой стороны, активное Mn 2 + транспорт количественно пропорциональна жизнеспособности, числа и электрической активности аксонов волокон. Для такого анализа мы примером Mn 2 + транспортные кинетики вдоль зрительной пути в трансгенных мышах (NF-kB р50 KO), где отображаются спонтанное атрофию сенсорные, в том числе визуальных, прогнозов. У этих мышей MEMRI указывает снижается, но не задерживается Mn 2 + транспорт по сравнению с мышами дикого типа, обнаруживая таким образом признаки структурных и / или функциональных нарушений на NF-kB мутаций.
Таким образом, MEMRI удобно соединяет в естественных условиях анализов и послеубойную гистологии для characterizatiна целостности нервных волокон и деятельности. Это очень полезно для продольных исследований по дегенерации аксонов и регенерации, и исследований мутантных мышей для подлинных или индуцибельных фенотипов.
Introduction
На основе его благоприятного нервно-анатомические структуры грызун визуальная система предоставляет уникальные возможности для оценки фармакологических соединений и их способность быть посредником нейропротекцию 1 или про-регенеративный эффект 2,3. Кроме того, она позволяет исследования по функциональной и нейро-анатомических характеристик мутантных мышей, как это недавно примера для мышей, лишенных пресинаптического строительных лесов белок Фагот 4. Кроме того, широкий спектр дополнительных инструментов дает дополнительные показывая сетчатки ганглиозных клеток (РГК) и РГК чисел аксонов, а также РГК деятельности, например, путем электроретинографии и поведенческих тестов и определения корковых перестроек оптическим визуализации внутренних сигналов. Новейшие технические разработки в лазерной микроскопии позволяют на месте визуализации регенерации РГК глубокой ткани флуоресцентной визуализации в целых монтирования образцов зрительного нерва (ON) и мозга. В этом histologческих подход, тетрагидрофуран основе ткани очистка в сочетании с легкой листовой флуоресцентной микроскопии позволяет решить одиночных волокон, что повторного ввода в деафферентированной ON и зрительного тракта 5. В то время как такие методы могли бы быть выше в разрешении и определения моделей роста, они не позволяют повторяющиеся и продольные анализ отдельных событий роста, которые особенно желательных оценить процесс долгосрочного регенерации.
С контрастным усилением МРТ был использован для минимально инвазивной визуализации проекции ретино-tectal у мышей и крыс 6,7. Это может быть достигнуто путем непосредственного внутриглазной доставке парамагнитных ионов (например, Mn 2 +) к клеток сетчатки. В аналоговых кальция, Mn 2 + включен в РГК somata через напряжения закрытого кальциевых каналов и активно транспортируется вдоль аксонов цитоскелета неповрежденной ON и зрительного тракта. В то время как он накапливается в ядрах мозгавизуального проектирования, т.е. латерального коленчатого тела (LGN) и верхний бугорок (SC), transsynaptic распространения в первичной зрительной коре появляется незначительным 8,9, хотя это может произойти 10,11. Под MR последовательности, парамагнитного Mn 2 + увеличивает MR контраст в основном за счет сокращения T 1 спин-решеточной релаксации 12. Такое Mn 2 + МРТ с (MEMRI) успешно применяется в различных нервно-анатомических и функциональных исследований крыс, в том числе оценки регенерации аксонов и дегенерации после ON травмы 13,14, точное анатомическое отображение ретино-tectal выступа 15 , а также определения аксонов транспортных характеристик после медикаментозного лечения 16. Последние уточнения в лекарственных, токсичности и кинетики нейронных Mn 2 + поглощение и транспорт, а также усовершенствованных протоколов МРТ расширили свое применение в исследованиях по трансгенныхмышей 9 с использованием 3 Tesla сканеры, обычно используемые в клинической практике 17.
Здесь мы представляем MEMRI протокол, подходящий для продольное естественных изображений мыши ретино-tectal проекции и примером его применения на основе оценки Mn 2 + в зависимости усиление сигнала в наивных и различных условиях нейродегенерацию. Наш протокол ставит конкретную акцент на сбор данных MR в умеренном 3 T магнитного поля, что, как правило, более доступны, чем выделенных сканеров животных. В наивных мышей, мы проиллюстрируем, как интенсивность сигнала тракта конкретных может быть существенно и воспроизводимо стать увеличилось после стекловидное тело (ivit) Mn 2 + приложения. Количественно, Mn 2 + распространения вдоль зрительной проекции происходит независимо от нормального процесса старения (измеряется от 3 до 26-месячным мышам) и приумножение не поддается визуальной стимуляции и адаптации к темноте. В противоположность этому, Mn <sдо> 2 + обогащение таламуса и среднего мозга центров уменьшается после острого НА травмы раздавить 18, а также в nfkb1 нокаут-мышей (р50 KO) страдает от спонтанного апоптоза РГК смерти и ПО дегенерации 19. Таким образом, в расширении к обычной гистологического анализа, продольный MEMRI анализ отдельных животных позволяет профилирование уникальных кинетики нейродегенеративных процессов. Это должно оказаться полезным для исследований по нейропротекции и регенерации аксонов, связанных с фармакологическими или генетических вмешательств.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEMRI зрительной системы распространяется обычные нейробиологические методики для оценки функциональности под наивных и патологических состояний. Помимо предоставления уникальную возможность заглянуть в целостности изолированной ЦНС волокна тракта, MEMRI может быть легко дополнен пов…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
АК поддерживается Oppenheim фонда и относительной влажности поддерживается Фондом Velux. Мы благодарим I. Krumbein технической и К. Будер для гистологического поддержки, Дж. Гольдшмидт (Лейбниц Институт нейробиологии, Магдебург, Германия) для технических консультаций по окрашиванию Тимм.
Materials
| Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
| Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
| Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
| Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
| 34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
| Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| Mouse holder | custom made | ||
| Red light lamp | |||
| Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
| Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
| Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 | |
Referências
- Kretz, A., et al. Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo. Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).
- Lima, S., et al. Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice. Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).
- Lima, S., et al. Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).
- Goetze, B., et al. Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons. Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).
- Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
- Pautler, R. G., et al. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).
- Watanabe, T., et al. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast. Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).
- Pautler, R. G. In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). NMR biomed. 17, 595-601 (2004).
- Haenold, R., et al. Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS. Neuroimage. 59, 363-376 (2012).
- Lindsey, J. D., et al. Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex. Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).
- Bearer, E. L., et al. Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI). Neuroimage. 37, S37-S46 (2007).
- Mendonca-Dias, M. H., et al. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).
- Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats. J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).
- Sandvig, I., et al. In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve. NMR biomed. 25, 620-631 (2012).
- Chan, K. C., et al. In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Neuroimage. 54, 389-395 (2011).
- Chan, K. C., et al. In vivo chromium-enhanced MRI of the retina. Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).
- Herrmann, K. H., et al. Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner. Magma. 25, 233-244 (2012).
- Villegas-Perez, M. P., et al. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Takahashi, Y., et al. Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival. Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).
- Herrmann, K. H. P., et al. MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners. Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).
- Danscher, G., Zimmer, J. An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues. Histochemistry. 55, 27-40 (1978).
- Angenstein, F., et al. Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice. Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).
- Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2). J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).
- Lehmann, K., et al. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).
- Takeda, A., et al. Manganese transport in the neural circuit of rat CNS. Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).
- Nairismagi, J., et al. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo. Neuroimage. 30, 130-135 (2006).
- Smith, K. D., et al. In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).
- Berkowitz, B. A., et al. Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).
- Schnapf, J. L. B. D. A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am. 256 (8), (1987).
- Yu, X., et al. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Sun, S. W., et al. Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).
- Sun, S. W., et al. Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).
