تسلسلي<em> في الجسم الحي</em> التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر
Summary
القياس الكمي وظيفة السلف العظام في كسر الشفاء يتطلب عالية الدقة تكنولوجيا التصوير المسلسل. هنا، وتقدم بروتوكولات لاستخدام intravital المجهري وتتبع أستيو-النسب بالتسلسل الصورة وتحديد الهجرة وانتشارها وتمايز الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم الذاتية في عملية إصلاح كسور العظام.
Abstract
العظام يقلب باستمرار والتجدد للغاية بعد الاصابة. منذ فترة طويلة تم الافتراض الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم في الوجود، ولكن في مظاهرة المجراة من مثل هذه الخلايا مؤخرا فقط تم تحقيقه. هنا، يتم توفيرها في الجسم الحي تقنيات التصوير للتحقيق في دور الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم الذاتية (OSPCs) وذريتها في إصلاح العظام. باستخدام الخلايا أستيو-النسب تتبع نماذج وintravital التصوير من microfractures يتسبب في العظام قبي، OSPCs يمكن ملاحظتها مباشرة خلال الأيام القليلة الأولى بعد الإصابة، التي تحدث الأحداث الحاسمة في عملية الإصلاح في وقت مبكر. مواقع الإصابة يمكن تصويرها بالتتابع كاشفا أن OSPCs الانتقال إلى الإصابة، وزيادة في عدد وتفرق في العظام تشكيل بانيات. هذه الطرق توفر وسيلة للتحقق في دور المنظمين الجزيئية الخلايا الجذعية الذاتية وخارجي لتجديد وإصلاح العظام.
Introduction
أمراض العظام التنكسية وفقدان العظام المرتبطة بالعمر مما يؤدي إلى ارتفاع مخاطر الاصابة بكسور هشاشة العظام أصبحت تشكل تحديا رئيسيا في مجال الصحة العامة 1. يتم التحكم بواسطة بانيات العظم الصيانة تشكيل العظام والخلايا الآكلة-resorbing العظام. عيوب تشكيل خلايا العظام هي السبب الرئيسي للالمرتبطة بالعمر فقدان العظام وأمراض العظام التنكسية 2،3. في حين ركزت بحوث واسعة النطاق على تحسين كسر الشفاء، واكتشاف العقاقير يمكن الاعتماد عليها لعلاج أمراض العظام التنكسية وعكس ضعف الكسور لا تزال مسألة هامة. وبالتالي، ودراسة مصدر خلايا العظام تشكيل وآليات الرقابة في تجديد وإصلاح العظام يوفر نظرة جديدة لتعزيز تجديد الهيكل العظمي وأمراض فقدان العظام عكس.
وقد اقترح وجود خلايا اللحمة المتوسطة متعددة القدرات في نقي العظام على أساس تحديد السكان مولد الرمع التي يمكن مختلفةIATE إلى المكونة للعظم، الأنساب مكون الشحم ومكون للغضروف فيفو السابقين 4. في الآونة الأخيرة، وأفادت الدراسات أن الخلايا الجذعية متعددة الهيكل العظمي / الوسيطة (جان معايير الأمان / اللجان الدائمة) هي مصدر طبيعي للبانيات وبالغة الأهمية بالنسبة لدوران العظام، يعيد البناء، وإصلاح الكسر 5،6 . بالإضافة إلى ذلك، كشفت دراستنا لتعقب النسب التي بانيات ناضجة لديها نصف حياة قصيرة بشكل غير متوقع (~ 60 يوما)، وتتجدد باستمرار عن طريق الخلايا الجذعية / السلف بهم في كل الظروف التماثل الساكن وإصلاح الكسر العادي 6. ومع ذلك، فإن الهوية في الجسم الحي من الخلايا الجذعية وكيف يمكن لهذه الخلايا تستجيب لكسر الإصابة وتزويد الخلايا المكونة للعظم غير واضحة. وبالتالي، فمن المهم وضع طريقة التي هي قادرة على تحليل الهجرة وانتشارها وتمايز جان معايير الأمان الذاتية / اللجان الدائمة في ظل الظروف الفسيولوجية.
إصلاح الكسر هو عملية متعددة الخلايا والحيوية التي تنظمها مجموعة معقدةالسيتوكينات وعوامل النمو 7. النهج الأكثر شعبية بالنسبة للدراسات الكسر هو استخدام نموذج حيواني مع كسور العظام الطويلة وتحليل العظام بواسطة باجتزاء العظام وتقنيات مناعي 8-10. يمكن رصد هذه العملية إصلاح بواسطة تقنيات متعددة بما في ذلك التصوير الجزئي-CT 11، الأشعة تحت الحمراء القريبة مضان 12، ومعان كيميائي التصوير 13. ومع ذلك، كل أسلوب له حدود معينة وكان هناك أي وسيلة فعالة لرصد وظيفة جان معايير الأمان / MSC على المستوى الخلوي في الجسم الحي. مؤخرا، تم تطوير متحد البؤر / ثنائي الفوتون intravital المجهري وتستخدم للكشف عن الخلايا السرطانية المزروعة والخلايا الجذعية المكونة للدم في سياق بهم المكروية نخاع العظم حتى في القرار وحيدة الخلية في الحيوانات الحية 14. من خلال الجمع بين هذه التكنولوجيا مع سلسلة من النسب نماذج البحث عن المفقودين، وكنا قادرين على تحديد أن الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف يمكن أن تكون علامة وراثيا من قبل ميلان عابرةtivation للمقاومة فيروس مخاطي -1 (MX1) المروج والأسلاف التي يسببها MX1 يمكن الحفاظ على أغلبية بانيات نضجا مع مرور الوقت ولكن لا تشارك في توليد غضروفية في الماوس الكبار 6. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن OSPCs MX1 المسمى تزويد غالبية بانيات جديدة في كسر الشفاء 6.
هنا، وذلك باستخدام نماذج تتبع أستيو-النسب وintravital المجهري، يتم توفير بروتوكول لتحديد حركية في الجسم الحي من MX1 + الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم في إصلاح الكسر. هذا البروتوكول يوفر التصوير المتتابع لتتبع نقل المكونة للعظم الساق / الأسلاف إلى مواقع الكسر والقياس الكمي للتوسع سليفة العظمية في عملية الإصلاح في وقت مبكر. قد يكون هذا النهج مفيدا في سياقات متعددة بما في ذلك تقييم المرشحين العلاجية لتحسين إصلاح العظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنظيم الخلايا الجذعية الهيكل العظمي قد تكون ذات أهمية كبيرة لتحديد أفضل الطرق لتحقيق تجديد العظام. وقد تم التصوير الكمي ومتتابعة على المستوى الخلوي تحديا تقنيا. على الرغم من أن الماوس العظام الطويلة نموذج الكسر قد استخدمت على نطاق واسع ومناسبة للدراسات النشاط الحيو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيم بارك لقراءة المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل NIAMS تحت رقم K01AR061434 جائزة وجائزة اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية جمعية زمالة (5127-09) لموانئ دبي والمنح من المعاهد الوطنية للصحة لCPL و DTS المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تعبر بالضرورة عن وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
