Sekventiel<em> In vivo</em> Imaging af Osteogene Stem / stamceller Under frakturreparation
Summary
Kvantitativ måling af knogle stamfader funktion i frakturheling kræver høj opløsning seriel imaging-teknologi. Her bliver protokoller indeholdt bruge intravital mikroskopi og osteo-slægt sporing sekventielt billedet og kvantificere migration, spredning og differentiering af endogene osteogene stamceller / stamceller i færd med at reparere knoglebrud.
Abstract
Bone vender løbende og er stærkt regenerativ efter skade. Osteogene stamceller / stamceller har længe været en hypotese at eksistere, men in vivo demonstration af sådanne celler er først for nylig er nået. Her er in vivo imaging teknikker til at undersøge, hvilken rolle af endogene osteogene stamceller / stamceller (OSPCs) og deres afkom i knogle reparation forudsat. Brug osteo-afstamning celle opsporing modeller og intravital billeddannelse af inducerede mikrobrud i calvarie knogle kan OSPCs observeres direkte i løbet af de første par dage efter skaden, hvor kritiske hændelser i det tidlige reparationen forekomme. Skader sites kan sekventielt filmede afslører, at OSPCs flytte til skaden, stige i antal og differentierer til knogledannende osteoblaster. Disse metoder giver et middel til at undersøge betydningen af stamcelle-indre og ydre molekylære regulatorer til knogle regenerering og reparation.
Introduction
Degenerative knogle sygdomme og aldersrelateret knogletab, der fører til en høj risiko for osteoporotisk fraktur er blevet en stor udfordring for folkesundheden 1.. Bone vedligeholdelse styres af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster. Fejl af knogledannende celler er en hovedårsag til aldersrelateret knogletab og degenerative knoglesygdomme 2,3. Mens omfattende forskning har fokuseret på forbedring af frakturheling, til opdagelsen af pålidelige lægemidler helbrede degenerative knogle sygdomme og til at vende den svage knoglebrud fortsat et vigtigt emne. Således studere kilden til knogledannende celler og deres kontrolmekanismer i knogleregenerering og reparation giver en roman indsigt at forbedre skelet regenerering og ophæve knogletab sygdomme.
Er blevet foreslået Eksistensen af multipotente mesenchymalceller i knoglemarven baseret på identifikation af klonogene befolkninger, der kunne anderledesIATE i osteogent, Adipogeniske og chondrogene slægter ex vivo 4.. nylig, flere undersøgelser har rapporteret, at skelettet / mesenkymale stamceller (SSC'erne / MSC) er en naturlig kilde af osteoblaster og er afgørende for knogleomsætningen, ombygning og frakturreparation 5,6 . Desuden er vores slægt-tracing undersøgelse viste, at modne osteoblaster har en uventet kort halveringstid (~ 60 dages) og bliver kontinuerligt fyldt med deres stamceller / stamceller i både normale homeostatiske og fraktur reparation vilkår 6. Imidlertid in vivo identitet stamceller og hvordan sådanne celler reagerer til at bryde skade og levere knogledannende celler er uklare. Derfor er det vigtigt at udvikle en metode, der er i stand til at analysere migration, spredning og differentiering af endogene SSC'erne / MSC i under fysiologiske forhold.
Frakturreparation er en multi-cellulær og dynamisk proces reguleres af en række kompleksecytokiner og vækstfaktorer 7. Den mest populære metode til frakturer studier er at bruge en dyremodel med lange knoglebrud og analysere knogler af knogle sektionering og immunfluorescerende teknikker 8-10. Denne reparation proces kan overvåges af flere billeddannelsesteknikker, herunder mikro-CT 11, nær-infrarød fluorescens 12 og kemiluminescens billeddannelse 13. Men hver teknik har visse begrænsninger, og der har ikke været nogen effektiv måde at overvåge SSC'erne / MSC-funktion på det cellulære niveau in vivo. For nylig har konfokal / to-foton intravital mikroskopi blevet udviklet og anvendt til at detektere transplanterede cancerceller og hæmatopoietiske stamceller i forbindelse med deres knoglemarvens mikromiljø selv ved encellede opløsning i levende dyr 14. Ved at kombinere denne teknologi med en række afstamning sporing modeller, var vi i stand til at definere, at osteogent stamceller / stamceller kan genetisk præget af forbigående acvation af myxovirus modstand -1 (MX1) promotor og MX1-induceret progenitorer kan bevare de fleste af modne osteoblaster over tid, men ikke deltager i dannelsen af chondrocytter i den voksne mus 6. Desuden har vi påvist, at MX1-mærkede OSPCs levere hovedparten af de nye osteoblaster i frakturheling 6.
Her, ved hjælp af osteo-slægt sporing modeller og intravital mikroskopi, er en protokol, forudsat at definere in vivo kinetik MX1 + osteogene stamceller / stamceller i fraktur reparation. Denne protokol giver sekventiel billeddannelse til at spore flytning af osteogene stamceller / stamfædre i fraktur steder og kvantitativ måling af osteoprogenitor ekspansion i begyndelsen af reparationsprocessen. Denne fremgangsmåde kan være anvendelig i flere sammenhænge, herunder vurdering af terapeutiske kandidater til forbedring knogleheling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reguleringen af skelet stamceller kan være af stor vigtighed for at definere bedre metoder til at opnå knogleregenerering. Kvantitative og sekventiel billedbehandling på celleniveau har været teknisk udfordrende. Selvom musen lange knoglebrud model er blevet meget udbredt og velegnet til biomekaniske undersøgelser 17, har sin dybe væv placering, ujævn fraktur størrelse, blødt vævsskader, og anvendelsen af stabiliserende fiksatorer begrænset sekventiel intravital billeddannelse. Her er en meto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker C. Park for at læse manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIAMS under Award nummer K01AR061434 og en Leukæmi & lymfom Society Fellowship Award (5127-09) til DP og tilskud på National Institutes of Health til CPL og DTS Indholdet er alene forfatternes ansvar og ikke nødvendigvis repræsenterer officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
