Séquentiel<em> In vivo</em> Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture
Summary
La mesure quantitative de la fonction progénitrices de l'os dans la guérison des fractures nécessite haute résolution technologie d'imagerie de série. Ici, les protocoles sont fournies à l'aide de la microscopie intravitale suivi et l'ostéo-lignée pour quantifier séquentiellement l'image et la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation de fracture osseuse.
Abstract
Os tourne en permanence et est fortement régénération suite à une blessure. Cellules souches / progénitrices ostéogéniques ont longtemps été émis l'hypothèse d'exister, mais sur une démonstration in vivo de ces cellules a récemment été atteints. Ici, les techniques d'imagerie in vivo dans d'enquêter sur le rôle des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes (OSPCs) et leur progéniture dans la réparation osseuse sont fournis. Utilisation de cellules ostéo-lignée traçage modèles et imagerie intravitale de microfractures induites dans les os de la voûte crânienne, OSPCs peut être directement observée au cours des premiers jours après l'accident, dans lequel les événements critiques dans le processus de réparation se produisent tôt. sites de blessures peuvent être visualisés en séquence révélant que OSPCs déplacer à la blessure, d'augmenter en nombre et se différencier en ostéoblastes formation osseuse. Ces méthodes offrent un moyen d'étudier le rôle des régulateurs moléculaires des cellules souches intrinsèques et extrinsèques pour la régénération et la réparation osseuse.
Introduction
Maladies dégénératives des os et la perte osseuse liée à l'âge, entraînant un risque élevé de fracture ostéoporotique est devenue un enjeu majeur de santé publique 1. maintien de l'os est contrôlée par les ostéoblastes formant l'os et les ostéoclastes de résorption osseuse. Défauts de cellules osseuses formant sont une cause principale de la perte osseuse liée à l'âge et les maladies dégénératives osseuses 2,3. Alors que de nombreuses recherches ont porté sur l'amélioration de la guérison de la fracture, la découverte de médicaments fiables pour guérir les maladies dégénératives osseuses et d'inverser la faiblesse des fractures ostéoporotiques reste un problème important. Ainsi, l'étude de la source de formation de cellules osseuses et de leurs mécanismes de contrôle de la régénération osseuse et la réparation concerne une nouvelle idée pour améliorer la régénération du squelette et inverser les maladies de perte osseuse.
L'existence de cellules mésenchymateuses multipotentes dans la moelle osseuse a été proposée sur la base de l'identification des populations clonogéniques différente qui pourraitLiée en ostéogénique, lignées adipogéniques et chondrogènes ex vivo 4. Récemment, plusieurs études ont montré que les cellules souches du squelette / mésenchymateuses (SSC / MSC) sont une source naturelle d'ostéoblastes et sont essentiels pour le renouvellement osseux, le remodelage et la réparation de fracture 5,6 . En outre, notre étude de la lignée de traçage révélé que les ostéoblastes matures ont une demi-vie de façon inattendue à court (~ 60 jours) et sont continuellement renouvelées par leurs cellules souches / progénitrices dans les conditions homéostatiques et la réparation des fractures normales 6. Cependant, l'identité in vivo de cellules souches et de la manière dont ces cellules réagissent pour fracturer des blessures et de fournir des cellules formant l'os ne sont pas claires. Par conséquent, il est important de développer un procédé qui est capable d'analyser la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses / SSC endogènes dans des circonstances physiologiques.
réparation de fracture est un processus multi-cellulaire et dynamique régie par un ensemble de complexecytokines et des facteurs de croissance 7. L'approche la plus populaire pour les études de fracture est d'utiliser un modèle animal avec fracture des os longs et d'analyser les os par sectionnement de la moelle et des techniques d'immunofluorescence 8-10. Ce processus de réparation peut être surveillée par plusieurs techniques d'imagerie, y compris les micro-CT 11, la fluorescence dans le proche infrarouge 12, et la chimioluminescence imagerie 13. Cependant, chaque technique a certaines limites et il n'y a pas moyen efficace de surveiller la fonction SSC / MSC au niveau cellulaire in vivo. Récemment, confocale / deux photons microscopie intravitale a été développé et utilisé pour détecter des cellules cancéreuses transplantées et les cellules souches hématopoïétiques dans le cadre de leur microenvironnement de la moelle osseuse, même à une seule cellule de résolution dans les animaux vivants 14. En combinant cette technologie avec une série de modèles lignée de recherches, nous avons pu définir que les cellules souches ostéogéniques / progénitrices peuvent être génétiquement marqués par ac transitoirevation de la résistance de myxovirus -1 (MX1), le promoteur et les progéniteurs induite MX1 peut maintenir la majorité des ostéoblastes matures au cours du temps, mais ne participent pas à la production de chondrocytes chez la souris adulte 6. En outre, nous avons démontré que OSPCs Mx1 marqués fournissent la majorité des nouveaux ostéoblastes dans la guérison des fractures 6.
Ici, en utilisant des modèles de suivi ostéo-lignage et la microscopie intravitale, un protocole est prévue pour définir la cinétique in vivo de Mx1 + cellules souches / progénitrices ostéogéniques dans la réparation des fractures. Ce protocole offre imagerie séquentielle pour suivre le déplacement de ostéogéniques souches / progéniteurs dans les sites de fracture et la mesure quantitative de l'expansion de ostéoprogénitrices dans le processus de réparation rapide. Cette approche peut être utile dans de multiples contextes, y compris l'évaluation des candidats thérapeutiques pour améliorer la réparation osseuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
La régulation des cellules souches du squelette peut être d'une grande importance pour définir de meilleures méthodes pour atteindre la régénération osseuse. Imagerie quantitative et séquentielle au niveau cellulaire a été un défi technique. Bien que le long os modèle de fracture de la souris a été largement utilisé et adapté pour les études biomécaniques 17, son emplacement profond des tissus, la taille de fracture inégale, lésions des tissus mous, et l'application des fixateurs d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions C. Park pour la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIAMS sous Award Nombre K01AR061434 et un prix Leukemia & Lymphoma Society Bourse (5127-09) à DP et des subventions des Instituts nationaux de la santé pour le CPL et DTS Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
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