Sequentiell<em> In-vivo-</em> Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair
Summary
Quantitative Messung der Knochenvorläuferfunktion in Frakturheilung erfordert hohe Auflösung Serienbildtechnologie. Hier werden Protokolle für die Verwendung von Intravitalmikroskopie und Osteo-Linie Tracking Bild sequentiell und Quantifizierung der Migration, Proliferation und Differenzierung der knochenbild endogene Stammzellen / Vorläuferzellen in den Prozess der Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.
Abstract
Knochen dreht sich ständig und ist sehr regenerative nach Verletzungen. Osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen haben die Hypothese aufgestellt worden, lange zu existieren, aber in vivo Nachweis solcher Zellen wurde erst kürzlich erreicht. Dabei sind in vivo bildgebende Verfahren, die Rolle von endogenem osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen (OSPCs) und deren Nachkommen in Knochenreparatur zu untersuchen ist. Mit Osteo-Linie Zellverfolgung Modelle und Intravital Bildgebung von induzierten Mikrofrakturen im Knochen Schädel kann OSPCs direkt während der ersten paar Tage nach der Verletzung, in der kritische Ereignisse in der frühen Reparaturprozess auftreten beobachtet werden. Verletzungsstellen nacheinander abgebildet werden enthüllt, dass OSPCs verlagern, um der Verletzung, vermehren und differenzieren sich in knochenbildenden Osteoblasten. Diese Methoden bieten ein Mittel zur Untersuchung der Rolle von Stammzellen-intrinsische und extrinsische molekulare Regulatoren für die Knochenregeneration und Reparatur.
Introduction
Degenerative Knochenerkrankungen und altersbedingten Knochenverlust führt zu einem hohen Risiko für osteoporotische Fraktur zu einer großen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit ein. Knochenerhalt wird von knochenbildenden Osteoblasten und Osteoklasten Knochen gesteuert. Mängel der knochenbildenden Zellen sind die Hauptursache der altersbedingten Knochenverlust und degenerative Knochenerkrankungen 2,3. Während umfangreiche Forschung hat sich auf die Verbesserung der Frakturheilung konzentriert, um die Entdeckung der zuverlässige Medikamente degenerative Knochenerkrankungen zu heilen und die Schwäche der osteoporotischen Frakturen umkehren bleibt ein wichtiges Thema. So studieren die Quelle der knochenbildenden Zellen und ihre Kontrollmechanismen in der Knochenregeneration und Reparatur stellt eine neuartige Einblicke in Skelett-Regeneration zu verbessern und umzukehren Knochenverlust Krankheiten.
Das Vorhandensein von multi mesenchymalen Zellen im Knochenmark wurde basierend auf der Identifikation von klonogenen Populationen vorgeschlagen, könnten unterschiedlicheiate in osteogene, chondrogene adipogene und Ex-vivo-Linien 4. kurzem mehrere Studien haben berichtet, dass Skelett / mesenchymale Stammzellen (SSC / MSC) sind eine natürliche Quelle von Osteoblasten und sind entscheidend für die Knochenumsatz, Umbau-, Reparatur-und Bruch 5,6 . Darüber hinaus unsere Linie-Tracing-Studie ergab, dass reife Osteoblasten haben eine unerwartet kurze Halbwertszeit (~ 60 Tage) und werden kontinuierlich durch ihre Stammzellen / Vorläuferzellen in beiden normalen homöostatischen und Bruchreparaturbedingungen 6 aufgefüllt. Die in vivo-Identität von Stammzellen und wie solche Zellen reagieren jedoch um Verletzungen zu zerbrechen und liefern knochenbildenden Zellen sind unklar. Daher ist es wichtig, eine Methode, die in der Lage, die Migration, Proliferation und Differenzierung endogener SSC / MSCs in unter physiologischen Bedingungen zu analysieren entwickeln.
Bruchreparatur ist ein vielzelliger und dynamischer Prozess durch eine Anordnung von komplexen geregeltZytokine und Wachstumsfaktoren 7. Die beliebteste Ansatz für die Bruch Studien ist es, ein Tiermodell mit langKnochenBruch zu nutzen und Knochen durch Knochen Schnitte und Immunfluoreszenz-Techniken 10.08 analysieren. Dieses Reparaturverfahren kann von mehreren Bildgebungstechniken einschließlich Mikro-CT 11, Nah-Infrarot-Fluoreszenz 12 und Chemilumineszenz Abbildungs 13 überwacht werden. Jedoch hat jede dieser Techniken bestimmte Beschränkungen und es wurde keine wirksame Möglichkeit, SSC / MSC-Funktion auf zellulärer Ebene in vivo zu überwachen. Kürzlich, konfokale / Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie wurde entwickelt und verwendet werden, um Krebszellen und transplantierten hämatopoetischen Stammzellen auch bei Single-Cell-Auflösung in lebenden Tieren 14 zu erfassen im Rahmen der ihr Knochenmark-Mikroumgebung. Durch die Kombination dieser Technologie mit einer Reihe von Linienverfolgungsmodelle, waren wir in der Lage, festzulegen, dass osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen genetisch durch transiente ac gekennzeichnetvierung des Myxovirus Widerstand -1 (MX1)-Promotor und Mx1-induzierte Vorläuferzellen können die Mehrheit der reifen Osteoblasten im Laufe der Zeit zu halten, aber nicht in der Erzeugung von Chondrozyten in der erwachsenen Maus 6 zu beteiligen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Mx1-markierten OSPCs liefern die Mehrheit der neuen Osteoblasten in Frakturheilung 6.
Hier mit Osteo-Linie Verfolgungsmodelle und Intravitalmikroskopie wird ein Protokoll vorgesehen, um die in vivo-Kinetik Mx1 + osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchreparatur zu definieren. Dieses Protokoll bietet sequentielle Bildgebung, um die Verlagerung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchstellen und die quantitative Messung der Osteoprogenitorzellen Expansion in der frühen Reparaturprozess zu verfolgen. Dieser Ansatz kann sinnvoll in mehreren Zusammenhängen einschließlich der Bewertung der therapeutischen Kandidaten für die Knochenreparatur zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Regulierung der Skelett Stammzellen von großer Bedeutung für die Definition bessere Methoden, um die Knochenregeneration zu erreichen. Quantitative und sequentielle Bildgebung auf zellulärer Ebene ist technisch anspruchsvoll gewesen. Obwohl die Maus Röhrenknochenfrakturmodell wurde weit verbreitet und eignet sich für biomechanische Studien 17, haben ihre tiefe Gewebestelle, unebene Bruch Größe, Weichteilschaden, und die Anwendung der stabilisierenden Fixateur sequentielle Bildgebung Intravital begr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken C. Park zum Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die Auszeichnung unter NIAMS Anzahl K01AR061434 und Leukemia & Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) zu DP unterstützt und Zuschüsse von den National Institutes of Health zu CPL und DTS Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
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