עוקב<em> בvivo</em> הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר
Summary
מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.
Abstract
עצם מתהפך ברציפות, והוא מאוד משובי בעקבות פציעה. תאי גזע / אב osteogenic כבר מזמן שיערו להתקיים, אבל בהפגנת vivo של תאים כאלה יש רק לאחרונה הושגו. כאן, in vivo בטכניקות הדמיה כדי לחקור את תפקידם של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני (OSPCs) וצאצאיהם בתיקון עצם מסופקות. שימוש בתא osteo שושלת התחקות דגמים והדמיה intravital של microfractures המושרה בעצמות calvarial, OSPCs ניתן לצפות ישירות במהלך הימים הראשונים לאחר פציעה, שבאירועים קריטיים בתהליך התיקון מוקדם להתרחש. אתרי פגיעה יכולים להיות צילמו ברצף חושפים כי OSPCs לעבור לפציעה, עלייה במספר ולהתמיין לosteoblasts עצם טביעה. שיטות אלה מציעים אמצעי חוקר את התפקיד של רגולטורים מולקולריים גזע תאים פנימיים וחיצוניים להתחדשות עצם ותיקון.
Introduction
מחלות עצם ניווניות ואיבוד מסת עצם הקשור לגיל שמוביל לסיכון גבוה לשברי אוסטיאופורוזיס הפך אתגר גדול בתחום בריאות ציבור 1. תחזוקת עצם נשלטת על ידי אוסטאובלסטים יוצרי עצם וosteoclasts resorbing עצם. פגמים של תאי עצם ויוצרים הם גורם עיקרי לאובדן עצם הקשור לגיל ומחלות עצם ניווניות 2,3. בעוד מחקר מקיף התמקד בשיפור של ריפוי שבר, את הגילוי של תרופות אמינות כדי לרפא מחלות עצם ניווניות ולהפוך את החולשה של שברי אוסטיאופורוזיס נשאר נושא חשוב. כך, לומד את המקור לתאי עצם יוצר ומנגנוני הבקרה שלהם בהתחדשות עצם ותיקון מספק תובנה רומן כדי לשפר את התחדשות שלד ולהפוך מחלות איבוד מסת עצם.
קיומם של תאי mesenchymal multipotent במח עצם הוצע מבוסס על זיהוי של אוכלוסיות clonogenic שיכול שונהiate לosteogenic, שושלות adipogenic וchondrogenic vivo לשעבר 4. לאחרונה, מחקרים רבים דיווחו כי תאי גזע השלד / mesenchymal (SSCs / MSCs) הם מקור טבעי של אוסטאובלסטים והם קריטיים עבור מחזור עצם, שיפוץ ותיקון שבר 5,6 . בנוסף, מחקר התחקות השושלת שלנו גילה שיש לי osteoblasts הבוגר מחצית חיים קצרים באופן בלתי צפוי (~ 60 ימים) ומתחדשים ללא הרף על ידי תאי גזע / אביהם בשני תנאי homeostatic ותיקון שבר רגילים 6. עם זאת, זהות vivo של תאי גזע וכיצד כגון תאים מגיבות לשברי פציעה ולספק תאי יוצרי עצם אינם ברורים. לכן, חשוב לפתח שיטה שהוא מסוגל לנתח את ההגירה, השגשוג והתמיינות של SSCs / MSCs אנדוגני בנסיבות פיסיולוגיות.
תיקון שבר הוא תהליך רב תאי ודינמי מוסדר על ידי מערך של מתחםציטוקינים וצמיחת גורמי 7. הגישה הפופולרית ביותר ללימודי שבר היא להשתמש במודל של בעלי חיים עם שבר ארוך עצם ולנתח את עצמות על ידי חתך עצם וטכניקות immunofluorescent 8-10. תהליך תיקון זה יכול להיות פיקוח על ידי שיטות הדמיה מרובות כולל 11 מיקרו-CT, הקרינה אינפרא אדום קרובה 12, וההדמיה chemiluminescence 13. עם זאת, לכל טכניקה מגבלות מסוימות ולא הייתה שום דרך יעילה כדי לעקוב אחר תפקוד SSCs / MSC ברמה התאית בגוף חי. לאחרונה, confocal / מיקרוסקופיה intravital שני הפוטונים פותחה ומשמשת לאיתור תאים סרטניים מושתלים ותאי גזע hematopoietic בהקשר של microenvironment מח העצם שלהם אפילו ברזולוציה תא בודד חי חיות 14. על ידי שילוב של טכנולוגיה זו עם סדרה של דגמי התחקות שושלת, היינו יכול להגדיר שתאי גזע osteogenic / אב יכולים להיות מסומנים גנטי על ידי ac החולףtivation של התנגדות myxovirus -1 אמרגן (MX1) ואת אבות מושרה MX1 יכול לשמור על הרוב של osteoblasts הבוגר לאורך זמן, אך אינו משתתף בדור של כונדרוציטים בעכבר המבוגר 6. בנוסף, החוקרים הדגימו כי OSPCs כותרת MX1 לספק את רוב osteoblasts החדש בריפוי שבר 6.
כאן, תוך שימוש במודלי מעקב osteo שושלת ומיקרוסקופיה intravital, פרוטוקול מסופק להגדיר in vivo קינטיקה של + בתאי גזע / אב osteogenic MX1 בתיקון שבר. פרוטוקול זה מציע הדמיה רציפה כדי לעקוב אחר המעבר של גזע / אבות osteogenic לאתרי שבר ומדידת כמותית של התרחבות osteoprogenitor בתהליך התיקון מוקדם. גישה זו עשויה להיות שימושית בהקשרים רבים, כולל ההערכה של מועמדים טיפוליים לשיפור תיקון עצם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרגולציה של תאי גזע שלד עשויה להיות בעל חשיבות רבה להגדרת שיטות טובות יותר להשיג התחדשות עצם. הדמיה כמותי ורציפה ברמה התאית הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. למרות שמודל שבר ארוך עצם העכבר כבר בשימוש ומתאים למחקרים ביומכנית 17 נרחב, המיקום שלה רקמות עמוקות, גודל שבר לא …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג פרק לקריאת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS תחת מספר פרס K01AR061434 ואגודת מלגת פרס לוקמיה ולימפומה (5,127-09) לשארית פליטה ובמענקים מהמוסד הלאומי לבריאות לCPL ו-DTS התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
