Sequenziale<em> In vivo</em> Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione
Summary
La misurazione quantitativa della funzione progenitrici del midollo in guarigione della frattura richiede una tecnologia di imaging seriale ad alta risoluzione. Qui, sono ottenute utilizzando protocolli per microscopia intravitale e inseguimento osteo-lineage sequenzialmente immagine e quantificare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali endogene osteogenico / progenitrici nel processo di riparazione di fratture ossee.
Abstract
Bone gira continuamente ed è altamente rigenerante seguendo lesioni. Cellule staminali / progenitrici osteogenici sono stati a lungo ipotizzato di esistere, ma in vivo dimostrazione di tali cellule è stato solo di recente raggiunto. Qui, sono forniti vivo tecniche di imaging ad investigare il ruolo delle cellule staminali / progenitrici osteogenici endogeni (OSPCs) e la loro progenie in riparazione ossea. Utilizzando cellule osteo-lineage tracing modelli e immagini intravitale di microfratture indotte in osso cranica, OSPCs può essere direttamente osservato durante i primi giorni dopo la lesione, in cui si verificano eventi critici nel processo di riparazione precoce. Siti di lesione può essere ripreso in sequenza rivelando che OSPCs trasferirsi al pregiudizio, aumentare in numero e differenziarsi in osteoblasti che formano l'osso. Questi metodi offrono un mezzo per indagare il ruolo dei regolatori molecolari delle cellule staminali-intrinseci ed estrinseci per la rigenerazione e la riparazione ossea.
Introduction
Malattie degenerative delle ossa e perdita di massa ossea correlata all'età portando ad un elevato rischio di fratture osteoporotiche è diventata una sfida importante nella salute pubblica 1. Manutenzione Bone è controllato da osteoblasti che formano l'osso e osteoclasti osso-riassorbimento. Difetti di cellule che formano l'osso sono una causa principale di perdita di massa ossea legata all'età e le malattie degenerative delle ossa 2,3. Mentre la vasta ricerca si è concentrata sul miglioramento della guarigione della frattura, la scoperta di farmaci affidabili per curare le malattie degenerative delle ossa e per invertire la debolezza delle fratture osteoporotiche rimane una questione importante. Così, studiando la fonte di cellule ossee e dei loro meccanismi di controllo nella rigenerazione e riparazione ossea fornisce un quadro nuovo per migliorare la rigenerazione scheletrico e inverse malattie perdita ossea.
È stato proposto l'esistenza di cellule mesenchimali multipotenti nel midollo osseo basata sull'identificazione delle popolazioni clonogeniche che potrebbero diversaIATE in osteogenico, lignaggi adipogenico e condrogeniche ex vivo 4. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali scheletriche / mesenchimali (SSC / MSC) sono una fonte naturale di osteoblasti e sono fondamentali per il turnover osseo, ristrutturazione e riparazione di fratture 5,6 . Inoltre, il nostro studio-lineage tracing rivelato che gli osteoblasti maturi hanno inaspettatamente breve emivita (~ 60 giorni) e sono continuamente alimentati dalla loro cellule staminali / progenitrici in entrambe le normali condizioni omeostatiche e riparazione di frattura 6. Tuttavia, l'identità in vivo di cellule staminali e come tali cellule reagiscono a fratturarsi lesioni e la fornitura di cellule ossee sono chiari. Pertanto, è importante sviluppare un metodo che sia in grado di analizzare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle endogeni SSC / MSC in circostanze fisiologiche.
Riparazione della frattura è un processo multi-cellulare e dinamico regolato da una serie di complessicitochine e fattori di crescita 7. L'approccio più comune per gli studi di frattura è quello di utilizzare un modello animale con frattura delle ossa lunghe e analizzare ossa sezionando osso e tecniche di immunofluorescenza 8-10. Questo processo di riparazione può essere monitorato da più tecniche di imaging, tra cui micro-CT 11, vicino infrarosso fluorescenza 12, e chemiluminescenza immagini 13. Tuttavia, ogni tecnica ha alcune limitazioni e non vi è stato alcun modo efficace per monitorare la funzione SSC / MSC a livello cellulare in vivo. Recentemente, confocale / due fotoni microscopia intravitale è stato sviluppato e utilizzato per rilevare le cellule tumorali trapiantate e cellule staminali ematopoietiche nel contesto del loro microambiente midollare anche a risoluzione unicellulare in animali vivi 14. Combinando questa tecnologia con una serie di modelli di tracciamento lignaggio, siamo stati in grado di definire che le cellule staminali osteogenic / progenitrici possono essere geneticamente caratterizzati da ac transitoriativazione della resistenza myxovirus -1 (Mx1) promotore e progenitori MX1-indotta in grado di mantenere la maggior parte degli osteoblasti maturi nel tempo, ma non partecipare alla generazione dei condrociti nel topo adulto 6. Inoltre, abbiamo dimostrato che OSPCs MX1-etichettati forniscono la maggior parte dei nuovi osteoblasti in guarigione della frattura 6.
Qui, utilizzando modelli di monitoraggio osteo-lignaggio e la microscopia intravitale, un protocollo è prevista per definire la cinetica in vivo di + osteogenici cellule staminali / progenitrici MX1 nella riparazione della frattura. Questo protocollo offre immagini sequenziale per monitorare il trasferimento di osteogenici staminali / progenitori in siti di frattura e la misurazione quantitativa di espansione osteoprogenitrici nel processo di riparazione precoce. Questo approccio può essere utile in diversi contesti compresa la valutazione dei candidati terapeutici per migliorare la riparazione ossea.
Protocol
Representative Results
Discussion
La regolazione delle cellule staminali scheletriche può essere di grande importanza per definire i metodi migliori per raggiungere la rigenerazione ossea. Imaging quantitativo e sequenziale a livello cellulare è stato tecnicamente difficile. Sebbene il modello frattura delle ossa lunghe topo è stato ampiamente utilizzato e adatto per studi biomeccanici 17, la sua posizione tessuti profondi, dimensione frattura irregolare, danni ai tessuti molli, e l'applicazione di fissatori stabilizzanti hanno limitat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo C. Park per la lettura del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIAMS sotto Award numero K01AR061434 e Leukemia & Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) per DP e le sovvenzioni dei National Institutes of Health a CPL e DTS Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente l'opinione ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
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