순차<em> 생체 내</em> 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징
Summary
골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.
Abstract
뼈는 지속적으로 반전 높은 재생 부상을 따르고있다. 골 형성 줄기 / 전구 세포가 오랫동안 존재하는 가설이 있지만, 이러한 세포의 생체 내 데모 최근에 달성되었습니다. 여기에, 생체 이미징 기술 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 역할 (OSPCs)과 뼈 수리에 자신의 자손을 조사하기 위해 제공됩니다. 모델과 두 개관 뼈 유도 미세 균열의의 intravital 이미징을 추적 osteo-계보 세포를 사용하여, OSPCs 직접 초기 수리 과정에서 중요한 이벤트가 발생하는 부상 후 처음 몇 일 동안 관찰 할 수있다. 상해 사이트는 순차적으로 OSPCs가 부상으로 옮겨 놓을 수가 증가하고 뼈 형성하는 조골 세포로 분화 드러내는 이미지가 될 수있다. 이러한 방법은 뼈 재생 및 수리를위한 줄기 세포의 내장과 외부의 분자 규제의 역할을 조사하는 수단을 제공합니다.
Introduction
퇴행성 뼈 질환 및 골다공증 성 골절의 위험이 높은 선도 연령과 관련된 뼈 손실은 공중 보건의 1의 주요 과제가되고있다. 뼈의 유지 보수는 뼈가 형성 조골 세포와 뼈 resorbing 파골 세포에 의해 제어된다. 뼈 형성 세포의 결함은 연령과 관련된 뼈 손실 및 퇴행성 뼈 질환 2,3의 주요 원인입니다. 광범위한 연구는 골절 치료의 개선에 집중되었지만, 안정적인 약물의 발견은 뼈 퇴행성 질병을 치료 및 골다공증 성 골절의 약점을 취소하는 것은 중요한 문제가 남는다. 따라서, 골 재생 및 수리의 골 형성 세포 및 그 제어 메커니즘의 근원을 연구하면 골격 재생을 높이고 골 손실 질환을 반전하는 신규 한 통찰력을 제공한다.
골수에있는 다 능성 간엽 세포의 존재는 클론 원성 개체군의 식별에 기초하여 제안되었다 수 있었고 상이한골 형성에 늦었, 지방 형성과 연골 계보는 생체 4. 최근, 여러 연구는 골격 / 중간 엽 줄기 세포 (SSC가 / 엽 줄기 세포)는 조골 세포의 자연적인 원천 및 골 교체, 개조, 및 파괴 수리 5,6에 중요한 것으로보고있다 . 또한, 우리의 혈통 추적 연구는 성숙한 조골 세포가 예기치 않게 짧은 반감기 (~ 60 일)이 지속적으로 정상 항상성과 골절 수리 조건 6 모두 자신의 줄기 / 전구 세포에 의해 보충되는 것으로 나타났다. 그러나, 생체 내 줄기 세포의 정체성과 어떻게 이러한 세포는 부상 골절과 뼈 형성 세포가 불분명 공급하는 반응. 따라서, 생리적 상황에서 이주, 증식 및 내인성 개의 SSC / 엽 줄기 세포의 분화를 분석 할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
골절 수리 복잡한의 배열에 의해 규제 다세포과 역동적 인 과정이다사이토 카인과 성장 7 요인. 골절 연구에 가장 인기있는 방법은 긴 뼈 골절 동물 모델을 사용하여 뼈 절편 및 면역 형광 기법 8-10로 뼈를 분석하는 것이다. 이 복구 프로세스는 마이크로 – CT (11), 근적외선 형광 (12) 및 화학 발광 영상 (13)을 포함하여 다수의 영상 기술로 모니터링 할 수있다. 그러나 각 기술은 특정 제한 사항이 생체 내에서 세포 수준에서 SSC가 / MSC 기능을 모니터링하는 효과적인 방법이 없었다. 최근에, 공 초점 / 이광자의 intravital 현미경이 개발 및 동물에게 14 리빙 심지어 단일 셀 해상도 그들의 골수 미세 환경의 컨텍스트에서 이식 된 암세포 및 조혈 줄기 세포를 검출하기 위해 사용되어왔다. 계보 추적 모델 시리즈 기술을 결합함으로써, 우리는 골 형성 줄기 / 전구 세포는 유전자 변이 (AC)에 의해 표시 될 수 있음을 정의 할 수 있었다믹소 바이러스 저항 -1 (MX1) 발기인 및 MX1 유도 조상의 tivation 시간이 지남에 성숙한 조골 세포의 대부분을 유지할 수 있지만, 성인 마우스 (6)에 연골 세포의 생성에 참여하지 않습니다. 또, MX1-표지 OSPCs은 골절 치료 6 새로운 골아 세포의 대부분을 공급하는 것을 보여 주었다.
여기에, osteo-혈통 추적 모델과의 intravital 현미경을 사용하여, 프로토콜은 골절 수리 MX1 + 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 역학을 정의하기 위해 제공됩니다. 이 프로토콜은 골절 사이트에 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이전 및 초기 수리 과정에서 osteoprogenitor 확장의 정량적 측정을 추적하기 위해 순차적으로 영상을 제공합니다. 이 접근법은 골 수선을 향상시키는 치료 후보의 평가를 포함한 여러 상황에서 유용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골격 줄기 세포의 조절은 골 재생을 달성하기 위해 더 나은 방법을 정의하기 위해 매우 중요 할 수있다. 세포 수준에서 정량 및 연속 촬영은 기술적으로 도전하고있다. 마우스 긴 뼈의 골절 모델이 널리 사용되는 생체 역학적 연구 (17)에 적합하였으나, 그 깊은 조직의 위치, 고르지 골절의 크기, 연부 조직 손상, 및 안정화 fixators의 응용 프로그램이 순차의 intravital 이미징을 제한했다. 여기…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고를 읽는 C. 공원 감사합니다. 이 작품은 상 수 K01AR061434 및 DP에 백혈병과 림프종 사회 원정대 수상 (5127-09)에서 NIAMS에 의해 지원 내용은 CPL 및 DTS에 건강의 국립 연구소의 보조금을하지 전적으로 저자의 책임이며 않는 한 반드시 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 나타냅니다.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
