Sekvensiell<em> In vivo</em> Imaging av osteogent Stem / stamceller under brudd Repair
Summary
Kvantitativ måling av benet progenitor-funksjonen i bruddheling krever høy oppløsning serieavbildningsteknologi. Her er protokoller gitt for å bruke intramikroskopi og osteo-avstamning sporing å sekvensielt bilde og kvantifisere migrasjon, spredning og differensiering av endogene osteogenic stilk / stamceller i prosessen med å reparere beinbrudd.
Abstract
Bone svinger over kontinuerlig og er sterkt regenerativ etter skade. Osteogene stammen / stamceller har lenge vært antatt å eksistere, men in vivo demonstrasjon av slike celler har nylig blitt oppnådd. Her er in vivo imaging teknikker for å undersøke hvilken rolle endogene osteogenic stilk / stamceller (OSPCs) og deres avkom i bein reparasjon gitt. Ved hjelp av osteo-avstamning celle tracing modeller og intra avbildning av indusert mikrofrakturer i calvarial bein, kan OSPCs observeres direkte i løpet av de første dagene etter skade, hvor kritiske hendelser i tidlig reparasjonsprosessen oppstår. Skadeloka kan sekvensielt avbildes avsløre at OSPCs omplassering til skaden, øke i antall og differensiere i bein forming osteoblaster. Disse metodene gir et middel for å undersøke hvilken rolle stamcelle-indre og ytre molekylære regulatorer for bein regenerering og reparasjon.
Introduction
Degenerative bein sykdommer og aldersrelaterte beintapet fører til en høy risiko for osteoporotiske brudd har blitt en stor utfordring i folkehelse en. Bone vedlikehold styres av bendannende osteoblaster og bein-resorbing osteoklaster. Defekter av bein forming celler er en viktig årsak til aldersrelatert bentap og degenerative bein sykdommer 2,3. Mens omfattende forskning har fokusert på forbedring av bruddtilheling, til oppdagelsen av pålitelige narkotika kurere degenerative bein sykdommer og for å reversere den svakhet av osteoporotiske brudd er fortsatt en viktig sak. Således studere kilden til skjelettdannende celler og deres kontrollmekanismer i benet regenerering og reparasjon tilveiebringer en ny innsikt for å øke skjelett regenerering og omvendt bentap sykdommer.
Eksistensen av multipotente mesenchymale celler i benmargen er foreslått basert på identifisering av clonogenic populasjoner som kunne annerledesIate inn osteogent, adipogenic og chondrogenic linjene ex vivo fire. Nylig, flere studier har rapportert at skjelett / mesenchymale stamceller (SSCS / MSCS) er en naturlig kilde til osteoblaster og er kritiske for bein omsetning, ombygging, og brudd reparasjon 5,6 . I tillegg er våre avstamning-tracing studie viste at modne osteoblasts har en uventet kort halveringstid (~ 60 dager) og blir kontinuerlig etterfylles av sine stilk / stamceller i både normale homeostatiske og brudd reparasjon forhold seks. Imidlertid er in vivo identiteten av stamceller, og hvor slike celler reagerer på brudd skade og leverer bendannende celler er uklar. Derfor er det viktig å utvikle en fremgangsmåte som er i stand til å analysere migrering, proliferasjon og differensiering av endogene SSCS / MSC på under fysiologiske forhold.
Fracture reparasjon er en multi-mobilnettet og dynamisk prosess regulert av en rekke kompleksecytokiner og vekstfaktorer 7. Den mest populære metode for fraktur-studier er å bruke en dyremodell med lang benbrudd og for å analysere ben ved ben seksjonering og immunofluorescent teknikker 8-10. Denne reparasjonsprosessen kan overvåkes av flere bildeteknikker inkludert mikro-CT 11, nær-infrarøde fluorescens 12, og kjemiluminescens avbildning 13.. Imidlertid har hver teknikk visse begrensninger, og det har ikke vært noen effektiv måte å overvåke SSCS / MSC-funksjon på cellenivå in vivo. Nylig har konfokal / to-foton intravital mikros blitt utviklet og brukt for å detektere transplanterte kreftceller og hematopoetiske stamceller i forbindelse med deres benmarg mikromiljøet selv ved encellede oppløsning i levende dyr 14. Ved å kombinere denne teknologien med en rekke avstamning tracing modeller, var vi i stand til å definere at osteogent stilk / stamceller kan være genetisk preget av forbigående acaktiverings av myxoviruset motstand -1 (MX1) promoter og MX1-indusert stamfedre kan opprettholde de fleste modne osteoblaster over tid, men deltar ikke i den generasjonen av chondrocytes i voksen mus seks. I tillegg viste vi at MX1-merket OSPCs forsyne flertallet av nye osteoblaster i bruddtilheling seks.
Her, ved hjelp av osteo-avstamning sporing modeller og intramikroskopi, er en protokoll for å definere in vivo kinetikk av MX1 + osteogenic stilk / stamceller i brudd reparasjon. Denne protokollen tilbyr sekvensiell avbildning å spore flytting av osteogenic stilk / stamfedre til bruddsider og kvantitativ måling av osteoprogenitor ekspansjon i tidlig reparasjonsprosessen. Denne fremgangsmåten kan være nyttig i flere sammenhenger, inkludert evalueringen av terapeutiske kandidater for å forbedre ben reparasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reguleringen av skjelett stamceller kan være av stor betydning for å definere bedre metoder for å oppnå ben regenerering. Kvantitativ og sekvensiell avbildning på cellenivå har vært teknisk utfordrende. Selv om musen lang beinbrudd modellen har vært mye brukt og passer for biomekaniske studier 17, har sin dype vev beliggenhet, ujevn brudd størrelse, mykt vev skade, og anvendelsen av stabiliserende fixators begrenset sekvensiell intra bildebehandling. Her er en metode for å overvinne disse begrensnin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker C. Park for å lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av den NIAMS henhold Award Antall K01AR061434 og leukemi og lymfom Society Fellowship Award (5127-09) til DP og tilskudd av National Institutes of Health til CPL og DTS Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
