Seqüente<em> In vivo</em> Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura
Summary
A medida quantitativa da função progenitor óssea na consolidação da fratura requer alta resolução tecnologia de imagens em série. Aqui, os protocolos são fornecidos para o uso de microscopia intravital e rastreamento osteo-linhagem sequencialmente imagem e quantificar a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos no processo de reparação de fratura óssea.
Abstract
Óssea vira continuamente e é altamente regenerativo após lesão. Células tronco / progenitoras osteogênicas têm sido a hipótese de existir, mas em demonstração vivo dessas células só recentemente foi atingido. Aqui, são fornecidos in vivo técnicas de imagem para investigar o papel das células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos (OSPCs) e seus descendentes na reparação óssea. Usando osteo-linhagem de células traçando modelos e imagens intravital de microfraturas induzidas no osso calvária, OSPCs podem ser observados diretamente durante os primeiros dias após a lesão, em que ocorrem eventos críticos no processo de reparo precoce. Sites de lesão pode ser trabalhada sequencialmente revelando que OSPCs mudar para a lesão, aumentam em número e diferenciação em osteoblastos do osso formando. Estes métodos oferecem um meio de investigar o papel dos reguladores moleculares Stem Cell-intrínsecos e extrínsecos para regeneração óssea e reparo.
Introduction
Doenças ósseas degenerativas e perda óssea relacionada à idade levando a um alto risco de fratura osteoporótica tornou-se um grande desafio para a saúde pública 1. Manutenção do osso é controlado pelos osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Defeitos de formação de células ósseas são uma das principais causas de perda óssea relacionada à idade e doenças ósseas degenerativas 2,3. Embora extensa pesquisa centrou-se na melhoria da consolidação da fratura, a descoberta de medicamentos confiáveis para curar doenças ósseas degenerativas e para reverter a fraqueza de fraturas osteoporóticas continua a ser uma questão importante. Assim, o estudo da fonte de células formadoras de osso e de seus mecanismos de controle na regeneração óssea e reparação oferece uma nova visão para melhorar a regeneração óssea e reverter doenças perda óssea.
A existência de células mesenquimais multipotentes da medula óssea foi proposto com base na identificação de populações clonogénicos que poderia diferenteIATE em osteogênico, linhagens adipogénicos e condrogênicas ex vivo 4. Recentemente, vários estudos têm relatado que as células-tronco do esqueleto / mesenquimais (SSC / CTM) são uma fonte natural de osteoblastos e são fundamentais para a renovação óssea, remodelação e reparo de fratura 5,6 . Além disso, nosso estudo de rastreamento de linhagem revelou que osteoblastos maduros têm uma meia-vida inesperadamente curto (~ 60 dias) e são continuamente reabastecidos pelas suas células tronco / progenitoras em ambas as condições homeostáticas e reparo de fratura normais 6. No entanto, a identidade in vivo de células estaminais e como tal as células reagem para fracturar lesão e fornecimento de células formadoras de osso não são claras. Portanto, é importante desenvolver um método que é capaz de analisar a migração, proliferação e diferenciação das CSCs endógenos / MSCs em circunstâncias fisiológicas.
Reparo de fratura é um processo multi-celular e dinâmica regulada por um conjunto de complexocitoquinas e factores de crescimento de 7. A abordagem mais popular para estudos de fratura é a utilização de um modelo animal com fratura de ossos longos e analisar ossos por seccionamento do osso e as técnicas de imunofluorescência 8-10. Este processo de reparação pode ser monitorado por várias técnicas de imagem, incluindo micro-CT 11, de infravermelho próximo de fluorescência 12, e imagens quimiluminescência 13. No entanto, cada técnica tem algumas limitações e não houve nenhuma maneira eficaz de monitorar a função SSC / MSC no nível celular in vivo. Recentemente, confocal / dois fotões microscopia intravital tem sido desenvolvido e usado para detectar células cancerosas transplantadas e células-tronco hematopoiéticas no contexto do seu microambiente da medula óssea, mesmo na resolução de uma única célula em animais vivos 14. Ao combinar essa tecnologia com uma série de modelos de rastreamento de linhagem, fomos capazes de definir que as células-tronco osteogênico / progenitoras podem ser geneticamente marcado por ac transitóriavação da resistência myxovirus -1 (Mx1) promotor e progenitores induzida-MX1 pode manter a maioria dos osteoblastos maduros ao longo do tempo, mas não participam na geração de condrócitos no rato adulto 6. Além disso, demonstrou-se que OSPCs Mx1 marcadas fornecer a maior parte dos novos osteoblastos em fratura cura 6.
Aqui, utilizando modelos de rastreamento osteo-linhagem e microscopia intravital, um protocolo é fornecido para definir os in vivo cinética de células-tronco + / progenitoras osteogênicas Mx1 no reparo de fratura. Este protocolo oferece imagens seqüenciais para acompanhar a deslocalização de osteogênicas tronco / progenitoras em sítios de fratura e a medição quantitativa de expansão osteoprogenitoras no processo de reparo precoce. Esta abordagem pode ser útil em vários contextos, incluindo a avaliação de candidatos terapêuticos para melhorar a reparação do osso.
Protocol
Representative Results
Discussion
O regulamento de células-tronco do esqueleto pode ser de grande importância para a definição de melhores métodos para alcançar a regeneração óssea. Imagens quantitativas e seqüencial no nível celular tem sido tecnicamente desafiador. Embora o modelo de fractura de ossos longos do rato tem sido amplamente utilizado e adequado para estudos biomecânicos 17, a sua localização de tecidos profundos, fractura tamanho desigual, danos nos tecidos moles, e a aplicação de fixadores de estabilização tê…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos C. Park para ler o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIAMS sob Award Número K01AR061434 e uma Sociedade Fellowship Award Leukemia & Lymphoma (5127-09) para DP e doações dos Institutos Nacionais de Saúde para CPL e DTS O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Referências
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