Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em> In vitro</em> İnme Model
Summary
Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.
Abstract
Bütün hayvan sistemlerini kullanırken, iskemik inme gibi nöropatolojik koşullarında yer moleküler mekanizmaları, incelenmesi, zor olabilir. Örneğin, birincil ya da "nöronal benzeri 'hücre kültür sistemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sistemler, çalışma için nispeten kolay olan ve (örneğin, hücre ölümü gibi) çeşitli işlevsel sonuçlar kolayca belirlenebilir hangi faydalı model sistemleri (örneğin, eksitotoksisite aracılı hücre ölümü yollar gibi) kültürlenmiş olgunlaşmamış nöronlarda muayene sonuçları ve yollar iken zorunlu olgun beyinde gözlenen aynı veya sağlam doku değildir. Bu nedenle, olgun sinir dokuda hücresel mekanizmalar incelenebilir hangi modeller geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Bu sağlam sinir dokusunda moleküler yollarının çeşitli araştırmak için kullanılan bir in vitro teknik geliştirdik. Bu tarifnamede tarif edilen teknik, sıçan kortikal doku kullanır, ancak bu teknik doku kullanmak için adapte edilebilirya da beyin bölgelerinde (örneğin, hipokampus, striatum, vb) (örneğin, fare, tavşan, kobay ve tavuk gibi) türlerin çeşitli. Buna ek olarak, uyarılar / çeşitli tedaviler (örneğin, eksitotoksik, inhibitörlerinin uygulanması, vs) kullanılabilir. Sonuç olarak, burada tarif edilen beyin kesit modeli eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler çeşitli mekanizmalar incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Inme en sık görülen serebral kan damarı tıkalı olduğunda oluşur iskemik inme, olduğunu. Kan akımının kesilmesinden kaynaklanan doku iskemisi membran depolarizasyonunu yaygın uyancı nörotransmitter salınımına neden olur ve hücre ölümünün aktivasyonuna yol açan hücre içi kalsiyum, sürekli yükseklik 1 yollar yer alır. Bu işlem, "eksitotoksisite" olarak geçecek olan ve inme 2 de dahil olmak üzere, çeşitli patolojilerin tarafından üretilen nöronal ölümle ilgili yaygın bir yoludur edilmiştir. Eksitotoksisite ve diğer nöronal hücre ölümü kaskadı dahil olan sinyal yollarının önlenmesi, inme sonrası nöronal hasarı sınırlandırmak için cazip bir yaklaşımdır.
Bütün hayvan sistemlerini kullanırken eksitotoksisite ve iskemik inme dahil kesin moleküler mekanizmaları belirlenmesi zor olabilir. Gibi, primer embriyonik ve 'nöronal-benzeri' (örn. neuroblasto olarakma ve adenokarsinom ölümsüzleştirdi hatları) hücre kültürü sistemleri sıklıkla kullanılır. Bu modellerin temel avantajları, nispeten düşük maliyetli manipüle edilmesi kolaydır ve hücre ölümü kolayca ölçülerek kantifiye edilebilir bulunmaktadır. Ancak, sinyal yolları kültürleme 3,4 kullanılan koşullar ve olgunlaşmamış nöronlar tarafından değiştirilmiş ve çizgileri farklı reseptörleri ifade ve beyni 5-8 olgun kıyasla sinyal molekülleri olabilir ölümsüzleştirdi edilebilir. (A kokültürü sistem kullanılırsa, ya da iki) olduğu gibi beyin dokusu birbirleri ile etkileşim hücre tipleri çeşitli içeren, heterojen ise Ayrıca, kültürlü nöronlar, sadece bir hücre tipinin bir inceleme sağlar. Organotipik kesit kültürü sistemleri (beyin dokusu ince dokusu) da kullanılabilir ve bunlar, in vivo olarak bulunanlar gibi bu modeller, heterojen hücre popülasyonlarının çalışma sağlar. Bu tekniği kullanarak, ancak, bir doku sadece sınırlı bir miktarda dilimleri, her hayvandan şekilde elde edilebilirSürece ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri olarak için kültürlenebilir, ve uzun süreli kültürde orta dilim yollarının ve reseptörler ve sinyal değişikliklere neden olabilir değildir. Olgun beyin Organotipik dilimleri üretmek için kullanılabilir iken, olgunlaşmamış beyninden dilim kültüre daha uygun olan ve daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Nöronal sinyal yolları incelenebilir hangi kullanımı kolay olan sağlam olgun beyin, temsil eder ya da taklit eden modeller geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Burada, bir eksitotoksik veya iskemik zedelenmeden sonra, hücre ölümü ile ilgili moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir sağlam sinir dokusu dahil, bir in vitro bir teknik tarif edilmektedir. Bu teknik, bir deney gerçekleştirmek için gerekli hayvan sayısını azaltır, tekrarlanabilir olduğunu, ve daha büyük Organotipik dilimleri için metabolik olarak benzer şekilde davranır canlı doku üretir. Buna ek olarak, nöronal devre, hücre etkileşimleri ve postsinaptik compartment kısmen bozulmadan kalır. Kullanılan fizyolojik tampon hücre 'tekrar kapatılması' için membranların ve sağlayan hücreler kendi özgün membran direncini 9 kurtarmak için olanak sağlar. Bu beyin dilim modeli sadakatle eksitotoksikliği bağlı beyin yaralanmaları 10 aşağıdaki gözlenen tepkiler taklit edebilir, ve inme dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, sağlam olgun beyin dokusunda eksitotoksisite ve iskemiye bağlı hücre ölümü ile ilgili moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir microslices üretilmesi için bir in vitro bir teknik tarif edilmektedir. Bu teknik, uygun bir doku (Şekil 1-3), yani daha büyük bir Organotipik dilimleri 15 metabolik benzer üretir. Ayrıca, bu microslice modeli yakından vivo 10 eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı aşağıdaki gözlenen te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü ve Newcastle Üniversitesi'nden araştırma fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
