Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em> In vitro</em> Model van een beroerte
Summary
We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.
Abstract
Onderzoeken moleculaire mechanismen betrokken bij neuropathologische aandoeningen, zoals ischemische beroerte, kan moeilijk zijn wanneer gebruik geheel dierlijke systemen. Als zodanig, primaire of 'neuronale-achtige' celkweek systemen vaak worden gebruikt. Hoewel deze systemen relatief eenvoudig om mee te werken en bruikbaar modelsystemen waarin verschillende functionele resultaten (bijvoorbeeld celdood) gemakkelijk kan worden gekwantificeerd, de onderzochte resultaten en routes in gekweekte onrijpe neuronen (bijvoorbeeld excitotoxiciteit-gemedieerde celdood routes) zijn niet noodzakelijkerwijs dezelfde als die waargenomen in volwassen hersenen, of in intact weefsel. Daarom is er de behoefte om modellen waarin cellulaire mechanismen volwassen neuraal weefsel kan worden onderzocht ontwikkelen. Wij hebben een in vitro techniek die kan worden gebruikt om een verscheidenheid van moleculaire pathways in intacte zenuwweefsel onderzoeken ontwikkeld. De hierin beschreven techniek maakt gebruik van rat corticale weefsels, maar deze techniek kan worden aangepast om weefsel te gebruikenuit diverse soorten (zoals muis, konijn, cavia en kip) of hersenen (bijvoorbeeld, hippocampus, striatum, enz.). Bovendien, een grote stimulaties / behandelingen worden gebruikt (bijvoorbeeld excitotoxische toediening van remmers, enz.). Concluderend kan de hersenen slicemodel hierin beschreven worden gebruikt om een verscheidenheid van moleculaire mechanismen-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken.
Introduction
De meest voorkomende vorm van een beroerte is ischemische beroerte, die optreedt wanneer een cerebraal bloedvat wordt afgesloten. Het weefsel ischemie die het gevolg is van stopzetting van de bloedstroom veroorzaakt wijdverspreide depolarisatie van membranen, afgifte van neurotransmitters prikkelende en aanhoudende verhoging van intracellulair calcium, hetgeen leidt tot de activatie van celdood pathways 1. Dit proces wordt genoemd "excitotoxiciteit 'en een gemeenschappelijke route betrokken bij neuronale dood door een verscheidenheid van ziekten, waaronder beroerte 2. Remming van de signaalwegen betrokken bij excitotoxiciteit en andere neuronale celdood cascades is een aantrekkelijke benadering van neuronale schade na een beroerte te beperken.
Het identificeren van de precieze moleculaire mechanismen betrokken bij excitotoxiciteit en ischemische beroerte kan moeilijk zijn bij het gebruik van hele dieren systemen. Als zodanig primaire embryonale en 'neuronale-achtige' (bv. neuroblastoma en adenocarcinoom onsterfelijk lijnen) celkweek systemen worden vaak gebruikt. De belangrijkste voordelen van deze modellen zijn dat ze gemakkelijk te manipuleren, relatief kosteneffectief en celdood kan gemakkelijk worden gemeten en gekwantificeerd. Echter, signaalwegen worden gewijzigd door de kweekomstandigheden gebruikte 3,4, en onvolwassen neuronen en vereeuwigd lijnen kunnen verschillende receptoren en signaalmoleculen, in vergelijking met de hersenen 5-8 rijpen. Bovendien gekweekte neuronen alleen wordt het onderzoek van een celtype (of twee, als een gemengde cultuursysteem gebruikt), terwijl intact hersenweefsel is heterogeen, met een verscheidenheid aan celtypen die met elkaar. Organotypische slice kweeksystemen (dunne explantaten van hersenweefsel) worden ook gebruikt en deze modellen kan de studie van heterogene populaties van cellen die worden aangetroffen in vivo. Echter, slechts een beperkte hoeveelheid weefsel Van elk dier bij gebruik van deze techniek kan plakkenniet gekweekt zolang geïmmortaliseerde cellijnen en middellange tot lange termijn kweek kan leiden tot veranderingen in signaalwegen en receptoren in de segmenten. Hoewel volwassen hersenen worden gebruikt organotypische plakjes genereren segmenten van onvolwassen hersenen ontvankelijker cultuur, en meer algemeen gebruikt. Er is dan ook de noodzaak om modellen die na te bootsen of te vertegenwoordigen intacte volwassen hersenen, die gemakkelijk te gebruiken zijn, waarin neuronale signaalwegen kan worden onderzocht ontwikkelen.
Hierin wordt een in vitro techniek die intacte zenuwstelsel die kunnen worden gebruikt om moleculaire mechanismen van celdood verhelderen na excitotoxische of ischemische insult beschreven. Deze techniek vermindert het aantal benodigde dieren een experiment uitgevoerd, reproduceerbaar en genereert levensvatbaar weefsel dat zich gedraagt op een metabolisch soortgelijke wijze grotere organotypische plakjes. Bovendien, de neuronale circuits, cellulaire interacties en postsynaptische compartment blijft deels intact. De fysiologische buffer gebruikt kan de celmembranen 'reseal' en stelt cellen hun oorspronkelijke membraanweerstand 9 herstellen. Deze brain slice model kan getrouw nabootsen responsen waargenomen na gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel 10, en kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen betrokken bij beroerte te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wordt een in vitro methode voor het genereren van microslices die kunnen worden gebruikt om de moleculaire mechanismen betrokken bij excitotoxiciteit en ischemie-gemedieerde celdood in intacte volwassen hersenweefsel onderzoeken beschreven. Deze techniek produceert levensvatbaar weefsel (figuren 1-3), dat is metabolisch vergelijkbaar met grotere organotypische plakjes 15. Bovendien is dit model microslice nauw overeenkomt met de respons waargenomen na excitotoxicity gemedieerd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de middelen voor onderzoek van de National Health and Medical Research Council of Australia, de Hunter Medical Research Institute en de Universiteit van Newcastle.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
Referências
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
