Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen
Summary
Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.
Abstract
Der Ubiquitin-Proteasom-Weg für den Proteinabbau wurde als einer der wichtigsten Mechanismen für die Regulierung eines breiten Spektrums von Zellfunktionen in praktisch allen eukaryontischen Organismen entstanden. Insbesondere bei Pflanzen, die Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS) regelt Proteinabbau und trägt wesentlich zur Entwicklung einer Vielzahl von Prozessen, einschließlich Immunantwort, die Entwicklung und den programmierten Zelltod. Darüber hinaus zunehmende Hinweise darauf, dass zahlreiche Pflanzenkrankheitserregern wie Agrobacterium, nutzen die Host-UPS für eine effiziente Infektion, die Bedeutung der USV in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen.
Die Substratspezifität der USV wird von der E3-Ubiquitin-Ligase, die in Abstimmung mit den E1-und E2-Ligasen wirkt, um spezifische Protein-Moleküle, die für Abbau bestimmt, indem es an diese Ketten von Ubiquitin-Moleküle zu erkennen und zu kennzeichnen erreicht. Eine Klasse der E3-Ligasen ist der SCF (Skp1 / CUllin / F-Box-Protein)-Komplex, der spezifisch das UPS Substrate und richtet sie für Ubiquitinierung über seine F-Box-Protein-Komponente. Um eine mögliche Rolle des UPS in einem biologischen Prozess von Interesse zu untersuchen, ist es wichtig, ein einfaches und zuverlässiges Assay für UPS-vermittelte Proteinabbau zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen solchen Assay unter Verwendung einer Pflanzenzelle freies System. Dieser Test kann für Studien über die Rolle der regulierten Proteinabbau in verschiedenen zellulären Prozessen angepasst werden, mit einem besonderen Fokus auf die F-Box-Protein-Substrat-Wechselwirkungen.
Introduction
Die Ubiquitin/26S Proteasom-Weg wird als weit verbreitete Mechanismus zur Steuerung der verschiedenen biologischen Reaktionen, einschließlich Transkriptionsregulation, Zellzyklusprogression und Signaltransduktion, Rezeptor-Down-Regulation oder Endozytose ua verarbeitet 1-4 Schwellen. In diesem Weg wird das Zielprotein durch Ubiquitin-Reste, die zunächst über eine Thiolester-Bindung an Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 befestigt sind und dann zu einem Cystein-Aminosäurerest von Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 transloziert markiert, und schließlich in Wechselwirkung mit E2 E3-Ubiquitin-Ligase , was Polyubiquitinierung des Proteinsubstrats. Schließlich werden die polyubiquitiniert Proteine durch das 26S-Proteasom erkannt und abgebaut. Bei diesem Mechanismus, der E3-Enzym spezifiziert das Substrat und fungiert als regulatorische Schlüsselkomponente des Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS). E3-Ligasen können unabhängig wie RING-Domäne-Ligasen, oder als Teil eines Multiunter SCF (S handeln,kp1/Cullin/F-box Protein)-Komplex, wie F-Box-Domäne-Ligasen. SCF-vermittelten proteasomalen Abbauwege sind in die Regulation der Transkription, Zellzyklus, Signaltransduktion 5-10 und vielen anderen wichtigen Zellfunktionen beteiligt.
Neben diesen kritischen Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen, UPS nimmt die zentrale Bühne in vielen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Zum Beispiel zunehmende Hinweise darauf, dass verschiedene Pflanzenkrankheitserreger, einschließlich Agrobacterium tumefaciens, verlassen sich auf die Host-USV für die Infektionsprozess 11 zu erleichtern. Agrobacterium entlockt neoplastischen Wucherungen an Pflanzen, die ihren natürlichen Wirten repräsentieren, und es kann auch verwandeln eine breite Palette von anderen Eukaryoten aus Pilzen 1,2 auf menschliche Zellen 12,13. Während der Infektion, Agrobacterium exportiert eine DNA-Element (T-DNA) und mehrere Virulenz (Vir)-Proteine in die Wirtszelle 12-13. Eines dieser Proteine ist VirF die erste F-Box-Protein gefundenvon einem prokaryotischen Genom 14 codiert werden. Im Rahmen der SCF-Ubiquitin-Ligase-Komplex, VirF, und seine funktionellen Homolog Host VBF 15, erleichtern Agrobacterium-Infektion über die USV-vermittelten Proteinabbau, die vermutlich erleichtert Uncoating der bakteriellen Invasion T-DNA aus Bakterien-und der dazugehörigen Wirtsproteine, VirE2 VIP1 und jeweils 16,17. Interessanterweise sind viele F-Box-Proteine, einschließlich VirF, intrinsisch instabil aufgrund ihrer eigenen Proteolyse, die durch autoubiquitination Aktivität 18,19 oder durch andere E3-Ligasen, für das F-Box-Proteine können als Substrate dienen 20-23 vermittelt wird.
Bei der Untersuchung von biochemischen Aktivitäten von F-Box-Proteine, andere Ubiquitin-Ligasen, und / oder ihre Substrate, wäre es sehr nützlich, um einen einfachen und zuverlässigen Test für den proteasomalen Abbau zu verwenden. Hier beschreiben wir ein solches Protokoll für die Analyse der Proteinstabilität in einer ZelleFreies System. In diesem Assay wird die Stabilität des UPS Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit eines der wesentlichen Bestandteile des proteasomalen Abbau-Weges, wie ein F-Box-Protein, in einem zellfreien System untersucht. Generell sprechen wir die getestet Protein (e) in Pflanzengeweben, bereiten zellfreien Extrakten aus diesen Geweben und überwachen die Mengen des Proteins (e) von Interesse durch Western-Blot. Die USV-abhängigen Mechanismus des Proteinabbaus wird durch die Aufnahme von spezifischen Proteasom-Inhibitoren und / oder mit Koexpression von dominant-negative Form eines SCF-Komponente Cullin demonstriert. Während wir veranschaulichen diesen Test unter Verwendung proteasomalen Abbau des Arabidopsis VIP1 17 Protein durch die F-Box-Protein VBF 15, kann es verwendet werden, um die Stabilität der anderen proteasomalen Substraten zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Assay beruht auf der Expression der untersuchten Proteine in Pflanzengeweben, so tritt offensichtlich das Potential proteasomalen Abbau Verfahren bereits in den lebenden Geweben. Wir untersuchen Protein Destabilisierung jedoch nur in den Extrakten, mit der Zeitnullprobe als erste Bezugspunkt dient. Daher definieren wir als zellfreie Assays.
Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Assays ist die richtige Wahl des Expressionsvektors aus dem das Protein getestet (n) erzeugt. Es…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit, die zu dieser Veröffentlichung hat die Finanzierung aus dem Marie-Curie-Programm COFUND "U-Mobility", die von der Universität von Malaga und der Europäischen Union 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter GA Nr. 246550 kofinanziert erhalten. Die Arbeit in unserem Labor wird durch Zuschüsse von NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, und BSF VC unterstützt
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
Referências
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