O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Resumo

Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.

Resumo

Canais iônicos controlar as propriedades elétricas dos neurônios e outros tipos de células excitáveis, permitindo seletivamente íons a fluir através da membrana plasmática ^1. Para regular a excitabilidade neuronal, as propriedades biofísicas de canais de iões são modificadas por proteínas e moléculas de sinalização, o que muitas vezes se ligam aos próprios canais de modo a formar um complexo do canal heteromérico de ^2,3. Ensaios tradicionais que examinam a interacção entre os canais e as proteínas reguladoras requerem rótulos exógenos que podem potencialmente alterar o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo, enquanto proporciona pouca informação sobre o curso de tempo de interacções em células vivas. Biossensores ópticos, como o sistema X-CORPO Biociências BIND Scanner, usar uma tecnologia sem rótulo novela, ressonância comprimento de onda grade (GRT) biossensores ópticos, para detectar mudanças na luz refletida ressonante perto do biossensor. Este ensaio permite a detecção da relativaalterar em massa no interior da porção inferior das células vivas aderentes à superfície do biossensor, resultante do ligando alterações induzidas na adesão celular e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação, e as alterações nas interacções proteína-proteína, perto da membrana do plasma. RWG biossensores ópticas têm sido utilizadas para detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a activação de receptores acoplados à proteína (GPCRs), tirosina-quinases receptoras, e os outros receptores da superfície celular. As alterações induzidas pelo ligando de iões de interacções proteína-canal também pode ser estudada utilizando este ensaio. Neste artigo, vamos descrever o procedimento experimental usado para detectar a modulação da Slack-B potássio ativado por sódio _(Na) K canais por GPCRs.

Introdução

Examinando as células vivas em seu contexto fisiologicamente relevante é crucial para entender as funções biológicas de alvos celulares. No entanto, os ensaios que examinam a interacção entre os canais e as proteínas citoplasmáticas de regulação, tais como ensaios de coimmunoprecipitation, geralmente fornecem pouca informação sobre o curso de tempo de interacções de células vivas. A maioria dos ensaios com base em células de corrente mede um evento celular específico, tal como a translocação de uma proteína de interesse fluorescente etiquetado. Estes ensaios requerem modificações das proteínas de interesse, o que pode, potencialmente, alteram o comportamento da prote....

Protocolo

1. Cultura de Células (Adaptado de Fleming e Kaczmarek ¹⁸⁾

1. Células de cultura em mídia apropriada para maior do que 2, mas menos de 10 passagens antes do uso neste ensaio. Não transfectadas células HEK-293 e células HEK-293 expressando estavelmente a proteína de rato Slack-B foram cultivadas em meio de Eagle uma metade de Dulbecco Modificado e metade meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado calor e antibióticos. 500 ug / ml de geneticina (G418) é adicionado a células HEK-293 que expressam estavelmente Slack-B para seleccionar para a expressão do canal de folga. Células de passagem em confluência de 70-90% por d....

Resultados

Slack-B transfectadas estavelmente células HEK-293 transfectadas e controlam as células HEK-293 foram semeadas a 1000 células / poço em 384 bem-ECM, placas revestidas com biossensores RWG. Imagens da central de 1,5 milímetros ² do biossensor foram gravadas com uma resolução de 3,75 mM / pixel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidade de massa foram gerados antes e 30 minutos após adição composto com o software BIND Scan. O BIND Ver software foi utilizado para determinar a mudança de VOP em .......

Discussão

O principal Z (Z ') é um factor de método estatístico comum para quantificar a qualidade de um ensaio de rastreio de alto rendimento ^{de 20,} e porque o rastreio de agonistas de GPCR neste ensaio ocorreram numa compatível ensaio de 384 cavidades SBS, proporciona uma excelente medida da robustez e validade deste ensaio ^21. Valor AZ 'de 1 indica um ensaio teoricamente ideal, com um número infinito de pontos de dados com desvios padrão inexistentes. Valor AZ 'entre 0,5-1 é considerado um exc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM, High Glucose	Life Technologies	11965-092
L-15 de Leibovitz Medium	Life Technologies	11415-064
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Geneticina G-418 Sulfato	Bioanalítico Americano	AB05057
HBSS	Life Technologies	14025-092
Fibronectina de plasma humano	Sigma-Aldrich	F0895
Albumina de clara de ovo de galinha	Sigma-Aldrich	A5378
DPBS	Life Technologies	14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocitômetro	Fisher Scientific	02-671-6
Cloreto de carbamoilcolina	Sigma-Aldrich	C4382
Sal de trifluoroacetato SFLLR-NH2	Sigma-Aldrich	S8701
Finnpipette (5-50 µ l)	Thermo Scientific	4662090
BIND	X-BODY Biosciences	N/A
384 poços TiO><2 placas revestidas	X-BODY Biosciences	TiO-96-CM

Sistema de scanner