L'utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines
Summary
Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.
Abstract
Les canaux ioniques contrôler les propriétés électriques des neurones et d'autres types de cellules pouvant être excitées sélectivement par des ions permettant de couler à travers la membrane plasmique 1. Pour réguler l'excitabilité neuronale, les propriétés biophysiques des canaux ioniques sont modifiées par les protéines et molécules de signalisation, qui se lient souvent les chaînes elles-mêmes pour former un complexe hétéromère de canal 2,3. Des dosages traditionnels examinant l'interaction entre les canaux et les protéines régulatrices exogènes exigent des étiquettes qui peuvent éventuellement modifier le comportement de la protéine et de diminuer l'importance physiologique de la cible, tout en fournissant peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. Des biocapteurs optiques, tels que le système X-CORPS Biosciences BIND Scanner, utilisent une technologie sans étiquette roman, résonance longueur d'onde de réseau (GTR) de biocapteurs optiques pour détecter les changements dans la lumière réfléchie de résonance près du biocapteur. Cet essai permet la détection de l'importance relativechanger dans la masse à l'intérieur de la partie inférieure des cellules vivantes adhérentes à la surface du biocapteur résultant de ligands changements induits dans l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération, et les changements dans les interactions protéine-protéine à proximité de la membrane plasmique. Biocapteurs optiques GTR ont été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), les tyrosine kinases de récepteur, et d'autres récepteurs de la surface cellulaire. Les changements induits dans les interactions ligand-protéine canal ionique peuvent également être étudiés dans cet essai. Dans cet article, nous allons décrire la procédure expérimentale utilisée pour détecter la modulation de la Slack-B potassium activée au sodium (Na) K canaux par les RCPG.
Introduction
D'examen des cellules vivantes dans leur contexte physiologiquement pertinent est essentielle pour comprendre les fonctions biologiques des cibles cellulaires. Cependant, des dosages examinant l'interaction entre les canaux et les protéines cytoplasmiques de régulation, tels que des essais de co-immunoprécipitation, fournissent généralement peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. La majorité des essais à base de cellules en cours de mesurer un événement cellulaire spécifique, tel que la translocation d'une protéine d'intérêt marqué de manière fluorescente. Ces tests nécessitent des modifications des protéines d'intérêt, qui peuvent potentiellement altérer le comportement de la protéine et de diminuer la pertinence physiologique de la cible. Des dosages à base de cellules non invasive, qui ne nécessitent pas la manipulation du système, fournissent une mesure en continu de l'activité cellulaire et permettant l'étude des cellules dans leur état le plus physiologiquement pertinent 4.
Des biocapteurs optiques sont conçues pour produireun changement mesurable dans une caractéristique de la lumière qui est couplée à la surface du capteur. Biocapteurs optiques qui utilisent des ondes évanescentes, qui comprennent la résonance de plasmon de surface (SPR) et de la longueur d'onde de résonance de réseau (GTR) techniques, ont été principalement utilisés pour détecter les affinités et la cinétique des molécules se liant à leurs récepteurs biologiques immobilisés sur la surface du capteur. Plus récemment, disponibles dans le commerce biocapteurs GTR ont été développés pour permettre la détection de la variation relative de masse à l'intérieur de la partie de fond de cellules adhérentes à la surface du capteur à haute résolution spatiale (jusqu'à 3,75 um / pixel) 5. Ces biocapteurs peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique de cellules vivantes qui résultent de la stimulation, telles que l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération et de voies de signalisation induites par une variété de récepteurs de surface cellulaire, y compris des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 6 . Biocapteurs GTR détecter le chan rapportge dans l'indice de réfraction en fonction de la variation relative de masse à l'intérieur de 150 nm du biocapteur 7. Lorsque les cellules sont étalées au biocapteur, cette variation de l'indice de réfraction reflète la variation de la masse à proximité de la membrane plasmique de la cellule résultant d'un changement dans l'adhésion cellulaire au biocapteur. Ce protocole va discuter de la détection des interactions protéine-canal à l'aide de biocapteurs GTR.
GTR systèmes d'acquisition de données sont constituées de plusieurs composants. Parce que le X-CORPS Biosciences BIND scanner a été utilisé pour ces expériences, nous désignerons les composants de ce système particulier, qui se compose d'un lecteur de plaque, les biocapteurs associés, logiciel d'acquisition BIND de numérisation, et le logiciel BIND Voir d'analyse 8. Les biocapteurs à cristaux photoniques, appelées ci-après en tant que biocapteurs optiques, sont constitués d'un agencement périodique d'un matériau diélectrique et en deux ou trois dimensions qui empêchent la propagation de la lumière au spécifiquelongueurs d'onde et les directions. Des structures à cristaux photoniques sont basés sur un phénomène appelé anomalie de Wood. D'abord découvert par Wood en 1902, ces anomalies sont les effets observés dans le spectre de la lumière réfléchie par des réseaux de diffraction optiques où les variations rapides de l'intensité de certains ordres de diffraction se produisent dans certaines bandes de fréquences étroites. En 1962, Hessel et Oliner présenté une nouvelle théorie des anomalies de bois dans laquelle période finie réseau génère une longueur d'onde de résonance permanente 9. Dans les biocapteurs optiques décrits ici, les anomalies de bois sont utilisés pour produire un biocapteur GTR que lorsqu'elles sont stimulées par la lumière blanche ne reflète que très étroite bande de longueurs d'onde (typiquement entre 850 à 855 nm).
Biocapteurs individuels se composent d'une matière plastique à faible indice de réfraction avec une structure de surface périodique qui est revêtue d'une mince couche de matériau diélectrique de dioxyde de titane de réfraction élevé (TiO 2). Lorsque les Biosensou est éclairée par une large source de lumière de longueur d'onde, le réseau optique de cristaux photoniques reflète une gamme étroite de longueurs d'onde de la lumière qui est mesurée par un spectrophotomètre dans le scanner de BIND. L'intensité maximale des longueurs d'onde réfléchies (Longueur d'onde crête valeur, ou VOP) est alors calculée à partir du signal. Le VOP de déplacements lumineux lors d'un changement de l'indice de réfraction à la suite d'une augmentation ou une diminution de la masse à l'intérieur de la proximité (~ 150 nm) de la surface du biocapteur. Des biocapteurs optiques sont intégrés dans une société de la norme des sciences biomoléculaires (SBS) de 384 puits de microplaques pour les analyses utilisées dans ces expériences.
biocapteurs RWV sont utilisés pour détecter des changements lors de l'addition des signaux exogènes dans des cellules vivantes 10. Les cellules sont cultivées directement sur la surface d'un biocapteur GTR et la variation de l'indice de réfraction locale est surveillée lors du traitement avec des stimuli spécifiques. Le sens de variation de la masse au biocapteur peut êtredéterminé, car une augmentation de l'indice local de réfraction à partir de résultats d'une augmentation de la masse près du biocapteur et est mesurée par une augmentation de la VOP. Inversement, une diminution de la masse entraîne une diminution de la VOP. Le changement dans la VOP détecté peut résulter de nombreux événements cellulaires, y compris les changements dans l'adhésion cellulaire, la protéine de recrutement / release, endocytose et exocytose, le recyclage, l'apoptose, et du cytosquelette réarrangement. Par exemple, le dosage peut être détecter les changements dans les interactions protéine-canal entre les canaux potassiques et d'autres composants cytoplasmiques ou du cytosquelette. L'état de cause, cependant, doit avoir lieu dans la zone de détection ~ 150 nm proche du biocapteur, et dans le cas d'une cellule attachée, à proximité de la membrane plasmique. Acquisition de réponses cellulaires est effectuée avec le logiciel d'analyse BIND et une représentation d'image de chacun des 384 puits de la plaque SBS est généré. Ce système a une résolution de jusqu'à 3,75 um / pixel, ce qui permet la détection d'événements dans des cellules individuelles, etpeut être utilisé soit avec des lignées cellulaires (par exemple, des cellules HEK293 ou CHO) ou avec plus physiologiquement pertinente des cellules primaires. analyse d'image avec BIND Voir logiciel permet la détection des réponses cellulaires à la fois individuelle et des populations de cellules. Comme les biocapteurs sont incorporés dans la norme SBS 384 puits des microplaques, le système est facilement adaptable à un criblage à haut débit (HTS).
-Longueur d'onde de résonance des biocapteurs optiques de réseau ont déjà été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation du GPCR 11. Notre laboratoire a cloné deux canaux potassiques (K Na) activé sodium, Slack-B et Slick 12. L'activité des deux canaux B et Slack-luisant a été montré pour être très fortement influencé par une activation directe de la protéine kinase C (PKC) 13. L'activation de la protéine Ga de q récepteurs couplés, tels que le récepteur muscarinique M1 et la glutamate métabotropiques mGluR1 receptor, régule puissamment l'activité des canaux grâce à l'activation de la PKC. Ces canaux K Na contribuent à l'adaptation neuronale pendant la stimulation soutenue et régulent la précision de la synchronisation des potentiels d'action 14. Chaînes lâches sont connus pour interagir avec une variété de molécules de signalisation cytoplasmiques, y compris FMRP, la protéine Fragile X Mental Retardation 15,16. Des mutations dans le résultat Slack dans plusieurs crises partielles Migration de la petite enfance (MMPSI), une forme précoce de l'épilepsie qui se traduit par un retard de développement sévère 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le premier de Z (Z ') de facteur est une méthode statistique commun pour quantifier la qualité d'un dépistage dosage à haut débit 20, et parce que le dépistage des agonistes de RCPG dans cet essai a eu lieu dans un essai de 384 puits compatible SBS, fournit une excellente mesure de la robustesse et de la validité de ce test 21. AZ "valeur 1 indique une analyse théoriquement idéale avec un nombre infini de points de données avec des écarts types inexistants. AZ "valeur c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Yangyang Yan dans le laboratoire du Dr Fred Sigworth à l'Université de Yale pour le généreux don de cellules HEK293 exprimant de façon stable la protéine rat Slack-B. En outre, les auteurs tiennent à remercier le Dr Sigworth pour cryo-microscopie électronique modèle d'homologie de Slack affiché dans la vidéo d'introduction. Cette recherche a été financée par le NIH subventions DH067517 et NS073943 à LKK
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
Referências
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