Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
Biz bir JPK AFM için, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) mikro / nano-çentikler kullanılarak bitki dokularının yüzeylerinin mekanik özelliklerini ölçmek için yeni geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokolde, çiçek meristemler, hipokotiller, ve köklerde x 100 um kadar 100 um'lik bölgeler arasında hücre içi çözünürlüklerde hücre duvarlarının belirgin Young modülüne ölçün. Bu numunenin dikkatli hazırlanması, mikro-indenters ve girinti derinliklerinde doğru seçimi gerektirir. Sadece, ölçümler hücreleri plazmolize ve böylece hücre turgor basınç katkı çıkarmak için manitol yüksek ölçüde konsantre çözeltiler içinde gerçekleştirilen hücre duvarı özellikleri hesaba katılması için.
Diğer kaybolmamış tekniklerin aksine, farklı çentikleri ve girinti derinliği kullanılarak, bu yöntem, aynı anda çok ölçekli ölçümleri sağlar: <em> Subsellüler çözünürlüklerde ve bir doku içeren hücrelerin genelinde yüzlerce yani. Bu, uzaysal-temporal tarzda büyümesi ve farklılaşması ile ilişkili olduğu için bu değişiklikleri sağlayan, geliştirme sırasında hücre çeperlerinin mekanik özelliklerinde yer alan karakterize etmek artık mümkün olduğu anlamına gelir. Bu koordineli mikroskobik hücresel değişiklikler makroskobik morfojenetik olaylar hakkında getirmek nasıl anlamak için önemli bir adımı temsil etmektedir.
Ancak, bazı sınırlamalar kalır: bu yöntem sadece (100 çapı um civarında) ve bu dış dokularda oldukça küçük numuneler üzerinde kullanılabilir; yöntem, doku topografya duyarlıdır; bu dokusunun karmaşık mekanik özelliklerinin sadece bazı yönlerini ölçer. Teknik hızla geliştirilmektedir ve bu sınırlamalar çoğu yakın gelecekte çözüleceğini olasıdır.
Introduction
Bitkilerde büyüme organizmanın her hücre çevreleyen sert hücre duvarlarının koordineli genişlemesi ile elde edilir. Giderek artan kanıtlar bu bitkiler, yerel olarak, bu genişleme kontrol eden hücre duvarı kimyanın tadilatı yoluyla olduğunu gösterir. Genişleme hücrenin yüksek turgor basıncının neden olduğu hücre duvarları, üzerinde yük öncelikle tahrik olması düşünülmektedir; turgor basıncına bu gerginlik tepkisi hücre duvarlarının 1'in mekanik özellikleri tarafından yönetilir. Küçük bu mekanik özellikleri bilinen ve geliştirme sırasında nasıl değiştiğini. Ayrıca biraz bu mekanik özellikleri geribildirimler görünüşte bir doku boyunca koordineli bir şekilde hücre duvarı kimyasını değiştirmeye katkısı olup olmadığını kontrol edilir ve nasıl bilinir. Biz kimyasal ve mekanik gelişimi sırasında bitki hücre duvarlarında değişiklikler ve sonuçta nasıl bu mikroskobik etkileşimlerin bir bitkiyi yöneten arasındaki bağlantıyı anlamak için ise'In makroskopik büyümesi, hücre ya da doku ölçeğinde organları geliştirilmesinde hücre çeperlerinin mekanik özelliklerini izlemek için bir yöntem gereklidir.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi mikrometre veya nanometre doku sıkıştırmasından ya da çentikler dayandığı, burada anlatılan, subselüler çözünürlüklerde aynı anda organları gelişmekte ve doku tüm bölgeler arasında hücre duvarlarının mekanik özelliklerini ölçmek için tam geliştirilmiştir. Diğer yöntemler var ya çok düşük ya da çok yüksek bir çözünürlük: Ekstansometrelerin milimetre ölçeğinde 2-4, erken olayları ölçmek için çok büyük örneğin bir ölçekte tüm doku ortalama mekanik özelliklerini ölçmek için sadece yapabiliyor Organogenezis; microindenter nanometre ölçeğinde hücre içi çözünürlükte ölçümlerini, ancak izole edilmiş hücreler olup hücre ya da organların 5-7 gruplarının ölçümü ile sınırlandırılmıştır. AFM ile, ihtiyaçd doku, hücre ve hücre içi çözünürlükleri 8-10 elde edilebilir. Son zamanlarda çok sayıda protokolleri de 11, 12, kullanılabilecek bitki doku mekanik ölçmek için özel olarak geliştirilmiştir.
Biz, belirgin Young modülü 13 ölçü dokuya elastikiyetini değerlendirmek nasıl burada sunacaktır.
Young modülü, genellikle bir malzemenin sertliğini tarif etmek için kullanılır. Küçük deformasyon esnasında bir malzemenin deforme edilmesi için gerekli kuvvet girinti alanı ile orantılıdır. Young modülü, bu katsayısıdır. Sürekli bir homojen madde durumunda, aynı katsayısı ne olursa olsun girinti tipi (boyut ve şekil) içinde ölçülür, ancak ölçüm hızı ile değişecektir. Bitki dokusunun bir kompleks yapının durumunda, şimdiye kadar kuvvet belirlenmesini sağlayan bir deformasyon orantılı olduğunu gözlemledikbiz "belirgin genç modülü" adını bir orantılılık katsayısı. Bitkilerde sürekli akışkanda ikinci Bunun aksine, bu bariz genç modülü girinti boyutuna duyarlıdır. Bu saf hücre duvarının genç modülünün karşılık gelmez. Bu, en iyi doku hücre duvarının iskele elastikiyetini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitkilerde, değişen mekanik özellikler büyüme ve morfolojilerinden yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Bugüne kadar orada bitki gelişimini kontrol genetik ve kimyasal ağları çözülüyor büyük ilerlemeler kaydedilmiş, ancak bu ağlar katkı ve mekanik özelliklerindeki değişikliklerden nasıl etkilendiğini bilgimiz ilkel gelmiştir. Bu yöntem, bu boşluğu doldurmak için bize imkan vermelidir, ve bu yüzden bitki büyümesi veya morfojenesis'in herhangi bir yönünü inceleyen bilimc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz birçok yararlı tartışmalar için Yves Couder özel şükrediyoruz. Biz dirseklerin ve tartışma kalibrasyonu için Aymen Asnacios teşekkür ederim. Biz eleştirel okuma Lisa Willis, Elliot Meyerowitz ve Oliver Hamant teşekkür ederim. Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0062/2005-C tarafından kısmen finanse edildi; Agence Nationale de la Recherche'''' Growpec'' ve'' Mechastem projeler.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
Referências
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
