新生儿软脑膜表面电穿孔
Summary
软脑膜表面是受到越来越多的关注，在中枢神经系统的唯一祖区。在此，我们详细为这个祖区使用改进的电穿孔法快速基因操作的方法。此过程可用于细胞和分子细胞谱系及参与细胞分化信号通路的调查，并阐明子细胞的命运和属性。
Abstract
在过去的几年中软脑膜表面已被确定为重要的生发利基胚胎，围产期和成年神经和gliogenesis期间，包括伤后。然而，对于基因询问这些祖人口和跟踪他们的谱系方法已经由于缺乏特异性或耗时的生产病毒的限制。因此，在该区域的进展一直只有少数这个位置的调查相对较慢。在出生后的大脑电已经使用了十多年，研究在胚胎神经干细胞的特性，以及最近。这里我们描述了一种高效，快速和简单的技术的基础上适合电穿孔的方法软膜表面祖细胞的遗传操作。软膜表面电允许这些祖细胞的浅显遗传标记和操纵，从而代表为研究这些细胞的一个省时省力又经济的方法。
Introduction
神经干细胞和祖细胞是存在于整个哺乳动物CNS 1，2。它们的性质和在周围的脑和脊髓的脑室区域胚胎和成年生发区属性已被广泛地记载在过去的十年中1-3。在很大程度上，这是由于越来越精确的遗传工具，如两侧装接loxP等位基因或逆转录病毒谱系追踪4的神经系统特异性表达Cre重组的发展。然而，一个祖区域软脑膜表面祖区，最近才在任何细节5-7被描述并等待全面的检查。
脑的软膜表面被定义为在脑表面和周围脑膜8之间的界面。在发育过程中，神经上皮，以及后来的放射状胶质年底脚连接到这个表面9,10。有些杉木ST的神经元在人脑和神经细胞的多丝分裂在此区域11的观察。后来，在胚胎神经，皮质的interneurons被称为遍历软脑膜地区，除了在中间区和脑室下区12-14它们的迁徙路线。在此期间，干细胞可以从该区域中进行培养，它似乎是神经和gliogenesis 5的活性位点。在成人大脑，它已经报道的interneurons可以从软脑膜表面祖细胞缺氧的挑战7诞生。然而，该地区对他的胚胎和出生后发育过程中genensis的贡献由于专门调查这一区域6的难度依然晦涩的部分。在上丘和在大脑皮质，表面（或层我在皮层）的interneurons可以调节下层兴奋性神经元群体的电路的输出，从而有助于significantly这些结构的功能。特别是，第1层的interneurons在首要的位置，调节神经元的整定其广泛的连接性皮质列15,16的浅表和深部层大脑皮层的上层射击。以类似的方式，水平的interneurons接受兴奋性输入从皮 质和视网膜纤维，项目在相对 宽的区域，并推测介导的抑制神经元群体响应远程视觉刺激17,18的。另外，其形态是非常适合于在显影视觉系统19中的图案化波活动中发挥潜在作用。有趣的是，interneuron发育和成熟发生很大程度出生后。另外，该成熟过程中已经发现，通过神经细胞的活动进行调节，因此对电路功能20,21终身后果发育可塑性的基板。值得注意的是，正Ø促销员的描述，可以专门针对这些细胞植入基因。除以祖细胞可以靶向与逆转录病毒7，但病毒产量是耗时并需要技巧，得到所需要的细胞转导的高滴度。
电穿孔导致了文艺复兴时期的神经发育的研究，因为它允许在神经祖细胞4，22，23信号通路的快速，高效的基因审讯。电穿孔涉及到注射的质粒DNA，随后递送电脉冲的头部的外侧，以单向驱动DNA导入周围的脑室4，22，23的增殖祖细胞。电显示通过细胞周期进行质粒的转基因24的表达M期，要求细胞的转运。具体而言，已经发现，只细胞通过内质粒电穿孔的8小时M期会表达外源基因，尽管他们有效地提供心室壁24的所有细胞内〜160微米。据推测，这是由于需要为核膜破裂在允许的附加 型质粒的核设施，如化学品导致的核通透性能诱导后有丝分裂细胞25质粒的表达。最初受聘于胚胎22，电穿孔，是深受26后，27适于用在出生后大脑。最近，我们已经适应了电穿孔的在软脑膜表面祖6遗传操作使用。此外，使用这种方法，我们已经表明，有明显的祖细胞的两个不同细胞系中此区域的元间和星形细胞6。该协议详细介绍了简单，快速，强大的方式来针对这些细胞进行审讯这些细胞的机制调节发展。
Protocol
Representative Results
Discussion
对软脑膜表面祖成功电穿孔的最关键方面是：1）靶向质粒组合到软脑膜表面; 2）避免血肿的发生在注射部位; 3）避免与电脑相关的死亡率。
适当地靶向软脑膜表面由头骨测量和小心刺入完成，以避免软膜表面的渗透。 1）位移后轻轻揉组织（ 即快绿是在皮肤和结缔组织头骨上面的本地化）的快速绿色染料与皮肤：针对不当上覆皮肤或基础脑室或脑实质将由证明或2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢支持，从塞缪尔Oschin全面癌症研究所癌症研究论坛奖，以及资金的雪松，西奈半岛的再生医学研究所和卡介苗家庭。描述该项目由美国国家研究资源中心，格兰特UL1RR033176资助的CTSI核心券的形式得到了支持，并且现在正处于国家中心推进转化科学，格兰特UL1TR000124。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
Referências
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neurociência. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
