신생아 Pial 표면 에레
Summary
pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.
Abstract
지난 몇 년 동안 pial 표면은 손상 후를 포함하여, 배아 산기 및 성인 신경과 gliogenesis 동안 중요성을 싹 틈새로 확인되었습니다. 그러나 유전이 전구 인구를 심문하고 그들의 계보를 추적하는 방법은 특이 또는 시간 바이러스의 생산을 소비의 부족으로 제한했다. 따라서,이 지역의 발전은이 지역의 연구 단지 소수의 상대적으로 느리다. 일렉트로은 배아의 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 년 넘게 사용하고, 최근에는 출생 후 뇌의되었습니다. 여기에 우리가 적응 일렉트로 방식에 따라 pial 표면 조상의 유전자 조작에 대한 효율적이고 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. Pial 표면 일렉트로 따라서 이러한 세포 연구를위한 시간 절약과 경제적 인 접근 방식을 나타내는 이러한 조상의 손쉬운 유전자 표시 및 조작 할 수 있습니다.
Introduction
신경 줄기 및 전구 세포는 포유 동물 CNS 1, 2에 걸쳐 존재한다. 자신의 성격과 뇌와 척수의 심실 지역 주변 배아와 성인 새싹 영역의 속성을 광범위하게 지난 십 1-3에 설명되어있다. 많은 부분에서, 이는 같은 floxed 대립 유전자 또는 4를 추적 레트로 바이러스 계통의 신경계 특정 크레 재결합으로 더욱 정확한 유전 도구의 개발에있다. 그러나 한 전구 지역 – pial 표면 전구 최근에 어떤 세부 5-7에 설명 된 영역 – 가지고 기다리고 종합 시험.
뇌 pial 표면은 뇌의 표면 및 주변 수막 8 간의 인터페이스로 정의된다. 나중에 개발, neuroepithelial하고, 동안, 반경 폐해 최종 피트는이 표면 9, 10에 연결합니다. 전나무의 일부인간의 두뇌와 신경 세포의 유사 분열의 많은 성 신경 세포는이 지역 11에서 관찰된다. 나중에 배아 신경 동안, 대뇌 피질의 interneurons는 중간 영역과 subventricular 영역 12 ~ 14에서의 이주 경로에 추가하여 pial 지역을 통과하는 것으로 알려져있다. 이 기간 동안, 줄기 세포는이 영역에서 배양 될 수 있고 신경 및 gliogenesis 5의 활성 부위로 나타난다. 성인의 뇌에서,의 interneurons는 저산소 도전 7 다음 pial 표면 조상에서 태어난 될 수 있음을보고하고있다. 그러나, 배아 및 출생 후의 개발 기간 동안 genensis하는 자신에 대한이 지역의 기여로 인해 특히이 지역 6 조사의 어려움으로 일부 모호한 남아있다. 우수한 둔덕과 대뇌 피질에, 표면 (또는 피질 층 I)의 interneurons는 기본 흥분성 신경 세포 집단의 회로 출력을 조절하고, 따라서 signific를 기여할 수있다이러한 구조의 기능에 antly. 특히, 1 층의 interneurons는 대뇌 피질의 열 (15, 16)의 표면과 깊은 층에 자신의 광범위한 연결 주어진 대뇌 피질의 상위 계층에서 뉴런의 발화를 조절하는 주요 위치에 있습니다. 유사한 방식으로, 가로의 interneurons는 비교적 넓은 면적에 걸쳐 피질 및 망막 섬유 프로젝트에서 흥분성 입력을 수신하고 원격 시각적 자극 (17, 18)에 응답 신경원 인구의 억제를 중재하는 추측된다. 또한, 그들의 형태는 현상 카메라 시스템 (19)의 패터닝 표면파 활동 전위 역할을 매우 적합하다. 흥미롭게도, interneuron의 개발과 성숙은 출생 후 큰 정도 발생합니다. 또한,이 숙성 공정은 신경 활성에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 따라서 회로 기능 (20, 21)의 평생 결과와 발달 가소성 기판이다. 특히, N오 발기인은 특히 transgenically이 세포를 표적으로 할 수있는 기술되어있다. 분할 전구 세포가 레트로 바이러스 7 대상이 될 수 있지만 바이러스의 생산 시간이 소요됩니다 세포 전달에 필요한 높은 역가를 산출하는 기술이 필요합니다.
이 신경 전구 세포 4, 22, 23의 신호 전달 경로의 신속하고 효율적인 유전자 심문을 허용으로 일렉트로는 신경 발달의 연구에서 르네상스를 주도하고있다. 전기 천공은 일방향 심실 4, 22, 23를 둘러싸고 증식 전구 세포로 DNA를 구동하는 헤드의 외부로의 전기 펄스의 전달 다음에 플라스미드 DNA의 주입하는 것을 포함한다. 일렉트로는 플라스미드 형질 전환 유전자 (24)의 식에 대한 세포주기의 M 단계를 통해 세포의 이동을 필요로 나타납니다. 구체적으로는 발견되었습니다 만이플라스미드의 일렉트로의 8 시간 이내 M 단계를 통과 세포는 심실 벽 (24)의 ~ 160 μm의 내의 모든 세포에 자신의 효과적인 전달에도 불구하고 도입 유전자를 표현하는 것입니다. 그것은 핵 permeabilization를 일으키는 화학 물질이 포스트 유사 분열 세포 (25)에 플라스미드의 발현을 유도 할 수있는이, 에피 솜 플라스미드의 핵 액세스를 허용 핵 봉투 고장의 필요성 때문이라고 추측된다. 원래 배아 22에 사용, 일렉트로는 훨씬 나중에 26, 27 출생 후의 뇌에 사용하기 위해 적응했다. 최근에, 우리는 pial 표면의 전구 세포 (6)의 유전자 조작에 사용하기 위해 전기 충격을 적응. 또한,이 방법을 사용하여 우리는 조상의 두 가지 계통이 지역 – interneuronal 및 성상 세포 6에 분명히 있다는 것을 보여 주었다. 이 프로토콜은 심문이 세포를 대상으로, 간단한 신속하고 강력한 방법의 자세한 사항이러한 세포의 조절 메커니즘 개발.
Protocol
Representative Results
Discussion
pial 표면 조상의 성공적인 일렉트로의 가장 중요한 측면은 다음과 같습니다 : 1) pial 표면에 플라스미드 믹스의 대상; 2) 주사 부위 혈종의 발생을 회피; 및 3) 중뇌 전기 천공과 연관된 사망률을 회피.
적절하게 pial 표면을 대상으로하는 pial 표면의 침투를 방지하기 위해 두개골의 측정 및주의 천공에 의해 달성된다. 부드럽게 조직 (즉, 빠른 그린이 피부와 결합 조직의 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 삼목 시나이의 재생 의학 연구소와 겔랑 가족에서 사무엘 Oschin 종합 암 연구소 암 연구 포럼 수상의 지원뿐 아니라 자금을 인정하고 싶습니다. 설명이 프로젝트는 연구 자원, 그랜트 UL1RR033176를위한 국가 센터에 의해 투자 CTSI 코어 바우처의 형태로 지원하고, 번역 상 과학, 그랜트 UL1TR000124 선진화를위한 국가 센터에 지금 하였다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
Referências
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neurociência. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
