Neonatal PIAL Surface Electroporation

Summary

Pial overflaten er en unik stamfar sone i CNS som får stadig større oppmerksomhet. Heri, we detalj en fremgangsmåte for hurtig genetisk manipulering av denne progenitor sonen ved hjelp av en modifisert metode electroporation. Denne prosedyren kan brukes til cellulære og molekylære undersøkelser av celle linjene og signalveier er involvert i celledifferensiering og å belyse skjebnen og egenskaper av datterceller.

Abstract

I løpet av de siste årene pial overflaten har blitt identifisert som en germinal nisje av betydning under embryonal, perinatal og voksen nevro-og gliogenesis, inkludert etter skade. Men metoder for genetisk avhøre disse progenitor populasjoner og sporing sine linjene hadde vært begrenset på grunn av manglende spesifisitet eller tidkrevende produksjon av virus. Således har utviklingen på dette område vært relativt langsomt med kun en håndfull av undersøkelser av denne plasseringen. Electroporation har blitt brukt i over et tiår å studere nevrale stamcelleegenskaper i embryo, og mer nylig i barsel hjernen. Her beskriver vi en effektiv, rask og enkel teknikk for genetisk manipulering av pial overflate progenitors basert på en tilpasset electroporation tilnærming. Pial overflaten elektroporering åpner for lettvinte genetisk merking og manipulering av disse stamfedre, og dermed representerer en tidsbesparende og økonomisk tilnærming for å studere disse cellene.

Introduction

Nevrale stamceller og stamceller er til stede i hele pattedyr CNS ^{1, 2.} Deres natur og egenskaper i embryonale og adulte germinale soner omkring de ventrikulære regioner av hjernen og ryggmargen har blitt grundig dokumentert i det siste tiåret ^1-3. I stor grad har dette vært på grunn av utviklingen av stadig mer presise genetiske verktøy, for eksempel nervesystemet bestemt Cre rekombinasjon av floxed alleler eller retroviral avstamning tracing ^fire. Men en stamfar region-pial overflaten stamfar sone-har bare nylig blitt beskrevet i detalj ^5-7 og venter omfattende undersøkelse.

Den pial overflaten av hjernen er definert som et grensesnitt mellom overflaten av hjernen og de ​​omkringliggende meninges ^8. Under utviklingen neuroepithelial og, senere, radiale gliaceller slutt føtter feste til denne overflaten ^9,10. Noen av granst nevroner i den menneskelige hjerne og mange nevrale mitoses er observert i denne regionen ^11. Senere, under embryonisk neurogenesis, er kortikale interneuroner kjent for å traversere pial region, i tillegg til sin migrasjonsveier i den mellomliggende sone og subventricular sone ^12-14. I løpet av denne perioden, kan stamceller dyrkes fra denne sonen, og det ser ut til å være en aktiv side av nevro-og gliogenesis ^fem. I den voksne hjernen, har det blitt rapportert at interneurons kan bli født fra pial overflate progenitors følgende hypoksisk utfordring ^7. Men, har bidraget fra denne regionen til hans å genensis under embryonal og postnatal utvikling vært obskure delvis på grunn av vanskelighetene med spesifikt undersøke denne regionen ^seks. I den overlegne colliculus og i hjernebarken, kan overfladiske (eller laget jeg i cortex) interneurons modulere krets utgang av underliggende eksitatoriske nevroner bestander og dermed bidra significantly til funksjonen av disse strukturene. Spesielt lag 1 interneuroner er i glimrende posisjon til å regulere avfyring av nerveceller gjennom de øvre lagene av hjernebarken gitt sin omfattende tilkoblingsmuligheter til de overfladiske og dype lag av kortikale kolonner ^15,16. På lignende måte, horisontale interneurons mottar eksitatoriske input fra kortikale og retinal fibre, prosjekt over et forholdsvis bredt område, og er spekulert å mediere hemming av neuronale populasjoner som svarer til fjern visuelle stimuli ^17,18. Dessuten er deres morfologi godt egnet til å spille en potensiell rolle i den mønstrede bølgeaktivitet i utviklings visuelle systemet ^19. Interessant, interneuron utvikling og modning skjer i stor grad etter fødselen. Dessuten har denne modningsprosessen er funnet å være regulert av neuronal aktivitet og er derfor et substrat av utviklings plastisitet med livslang konsekvenser på kretsfunksjon ^20,21. Spesielt, no arrangører er beskrevet som kan spesifikt mot disse cellene transgenically. Oppdeling av stamceller kan målrettes med retrovirus ^7, men virusproduksjon er tidkrevende og krever dyktighet for å gi de høye titere som er nødvendig for celle transduksjon.

Electroporation har ført til en renessanse i studiet av neurodevelopment som det gir mulighet for rask og effektiv genetisk avhør av signalveier i nevrale stamceller ^{4, 22, 23.} Electroporation innebærer injeksjon av plasmid-DNA, etterfulgt av leveringen av elektriske pulser til utsiden av hodet, for å ensrettet drive DNA inn i de prolifererende stamceller som omgir ventriklene ^{4, 22, 23..} Electroporation ser ut til å kreve transport av celler gjennom M-fasen av cellesyklusen for ekspresjon av plasmid transgener ^24. Nærmere bestemt er det blitt funnet at bareceller som passerer gjennom M fase innen 8 hr av elektroporering av plasmider vil uttrykke transgener til tross for deres effektiv levering til alle cellene i ~ 160 mikrometer av ventrikkel veggen ^24. Det er spekulert på at dette er på grunn av behovet for atom konvolutt sammenbrudd i slik at for atom tilgang av episomal plasmider, som kjemikalier forårsaker atom permeabilization kan indusere ekspresjon av plasmider i innlegget mitotiske celler ^25. Opprinnelig benyttet i embryo ^22, ble elektroporering tilpasset for bruk i postnatal hjernen mye senere ^{26, 27.} Nylig har vi tilpasset electroporation for bruk i den genetiske manipulering av pial overflate progenitorer ^6. Videre, ved hjelp av denne tilnærmingen vi har vist at det er tydeligvis to forskjellige linjer av stamfedre i denne region-interneuronal og astrocytic ^seks. Denne protokollen detaljer en enkel, rask og effektiv måte å målrette disse cellene for avhøreti mekanismene som regulerer utviklingen av disse cellene.

Protocol

Denne fremgangsmåten er i samsvar med Cedars-Sinai IACUC krav. Etterforskerne skal sikre institusjonell IACUC etterlevelse før du fortsetter. Alle verktøy og reagenser bør steriliseres før bruk. En. Utarbeidelse av verktøy, løsninger, og DNA Blanding Sett 100-mm brann polert borsilikatglass kapillarrør inn en mikropipette avtrekker. Sett oppvarming for å tillate standard vektet pull å danne pipettespissen på ca 17,5 mm. Skjær tips med skarpe kirurgiske sakser i en avst…

Representative Results

Pial overflate electroporation resulterer i ekspresjon av plasmid-DNA i celler, for det meste-progenitorer ved eller nær pial flaten 6. Mer spesifikt, er orienteringen av elektrodene kritisk i dikterer retning av plasmid bevegelse og påfølgende ekspresjon. Således, i to elektrode-konfigurasjoner, er plasmidet rettet i nesten rett vektor mellom den negative og positive elektroden. Derfor, hvis negative pol er plassert over injeksjonsstedet, og den positive pol er ventral til den negative pol, plasmid vil b…

Discussion

Den mest kritiske aspekt for vellykket elektroporering av pial overflate progenitorer er: 1) målretting av plasmid blanding til pial overflaten; 2) å unngå generering av hematomer på injeksjonsstedet; og 3) å unngå dødelighet assosiert med midthjernen elektroporering.

Hensiktsmessig rettet pial overflate oppnås ved målte og forsiktig punktering av hodet for å unngå gjennomtrengning av pial overflate. Feilaktig målretting til den overliggende hud og underliggende ventrikkel eller …

Materials

Item Name	Vendor	Catalog Number
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09