Neonatal pial Surface Elektroporation

Summary

Pial overflade er en unik stamfader zone i CNS, som modtager stigende opmærksomhed. Heri vi detaljeret en fremgangsmåde til hurtig genetisk manipulation af denne progenitor zone anvendelse af en modificeret elektroporation metode. Denne procedure kan bruges til cellulære og molekylære undersøgelser af cellelinier og signalveje, der er involveret i celle differentiering og at belyse skæbne og egenskaber datterceller.

Abstract

I løbet af de sidste mange år pial overfladen er blevet identificeret som en germinale niche vigtigt under embryonale, perinatal og voksne neuro-og gliogenesis, også efter skade. Imidlertid havde metoder for genetisk afhøre disse progenitorpopulationer og sporing deres slægter været begrænset på grund af mangel på specificitet eller tidskrævende produktion af virus. Således har udviklingen i denne region været forholdsvis langsom med kun en håndfuld af undersøgelser af denne placering. Elektroporation har været brugt i over et årti at studere neurale stamceller egenskaber i embryonet, og for nylig i den postnatale hjerne. Her beskriver vi en effektiv, hurtig og enkel teknik til genetisk manipulation af pial overflade progenitorer baseret på en tilpasset elektroporation tilgang. Pial overflade elektroporation giver mulighed for letkøbt genetisk mærkning og manipulation af disse stamfædre, og dermed repræsenterer en tidsbesparende og økonomisk tilgang til at studere disse celler.

Introduction

Neurale stamceller og stamfaderceller er til stede i hele pattedyrs CNS ^{1, 2.} Deres art og egenskaber i embryonale og voksne germinale zoner omkring de ventrikulære områder af hjernen og rygmarven er blevet grundigt dokumenteret i det seneste årti ^1-3. I store del, har det været på grund af udviklingen af stadig mere præcise genetiske værktøjer, såsom nervesystemet specifik Cre rekombination af floxet alleler eller retroviral afstamning sporing ^4. Men en stamfader region-pial overflade stamfader zone-har først for nylig blevet beskrevet i detaljer ^5-7 og afventer omfattende undersøgelse.

Pial hjernens overflade defineres som grænsefladen mellem overfladen af hjernen og de ​​omkringliggende meninges ^8. Under udviklingen neuroepitel og senere radiale gliøse ende fødder tillægger denne overflade ^9,10. Nogle af granst neuroner i den menneskelige hjerne, og mange neuronale Mitoser observeres i denne region ^11. Senere under embryonisk neurogenese er corticale interneuroner kendt for at krydse pial region, udover deres træk i den mellemliggende zone og subventricular zone ^12-14. I løbet af denne periode, kan stamceller dyrkes fra denne zone, og det ser ud til at være et aktivt sted i neuro-og gliogenesis ^5.. I den voksne hjerne, er det blevet rapporteret, at interneurons kan fødes fra pial overflade stamfædre efter hypoxisk udfordring ^7. Imidlertid har bidraget i denne region til sin til genensis under embryonisk og postnatal udvikling forblev uklar delvis på grund af vanskeligheden ved specifikt at undersøge dette område ^6. I den overlegne colliculus og i hjernebarken kan overfladiske (eller lag I i cortex) interneuroner modulere kredsløbet produktion af underliggende excitatoriske neuron befolkninger og dermed bidrage væsentligtantly til funktionen af ​​disse strukturer. Især Lag 1 interneuroner er i den bedste position til at regulere affyring af neuroner i hele de øverste lag af hjernebarken givet deres omfattende forbindelse til de overfladiske og dybe lag af kortikale søjler ^15,16. På en lignende måde, vandrette interneuroner modtager stimulerende input fra kortikal og retinale fibre, projekt over et relativt stort område og er spekuleret at mediere hæmning af neuronale populationer reagerer på remote visuel stimuli ^17,18. Også deres morfologi er velegnet til at spille en potentiel rolle i den mønstrede bølge aktivitet i udviklingslandene visuelle system ^19. Interessant interneuron udvikling og modning sker i vid udstrækning postnatalt. Endvidere har denne modningsproces er fundet at være reguleret af neuronal aktivitet og er derfor et substrat af udviklingsmæssige plasticitet med livslang konsekvenser for kredsløbsfunktion ^20,21. Især no promotorer er beskrevet som specifikt kan målrette disse celler transgent. Fjedre progenitorer kan målrettes med retrovirus ^7, men virusproduktion er tidskrævende og kræver dygtighed til opnåelse af de høje titere nødvendige for celle transduktion.

Elektroporation har ført til en renæssance i studiet af nervesystemets, da det giver mulighed for hurtig og effektiv genetisk interrogering af signalveje i neurale stamceller ^{4, 22, 23.} Elektroporation involverer injektion af plasmid-DNA, efterfulgt af levering af elektriske impulser til ydersiden af hovedet, til ensrettet drive DNA'et i prolifererende progenitorceller omkring ventriklerne ^{4, 22, 23.} Elektroporation synes at kræve transit af celler gennem M-fasen af cellens cyklus for ekspression af plasmid transgener ^24. Specifikt har det vist sig, at kunceller, der passerer gennem M fase indenfor 8 timer af elektroporation af plasmider vil udtrykke transgener trods deres effektiv levering til alle celler i ~ 160 um ventrikelvæggen ^24. Det spekuleres, at dette er på grund af behovet for opdeling kernemembranen at tillade for nuklear adgang for episomale plasmider, som kemikalier, der forårsager nuklear permeabilisering kan inducere ekspression af plasmider i post mitotiske celler ^25. Oprindelig ansat i embryonet ²² blev elektroporering tilpasset til anvendelse i den postnatale hjernen meget senere ^{26, 27.} For nylig har vi tilpasset elektroporering anvendes i genmanipulation af pial overflade progenitorer ^6. Desuden bruger denne tilgang, vi har vist, at der tilsyneladende er to forskellige slægter af forfædre i denne region-nye indbyrdes og astrocytisk ^6. Denne protokol beskriver en enkel, hurtig og effektiv måde at målrette disse celler til forhøraf mekanismer, der regulerer udviklingen af ​​disse celler.

Protocol

Denne procedure er i overensstemmelse med Cedars-Sinai IACUC krav. Efterforskere skal sikre institutionel overholdelse IACUC forud for proceduren. Alt værktøj og reagenser skal steriliseres inden brug. 1.. Udarbejdelse af værktøj, Solutions, og DNA Blanding Indsæt 100 mm brand poleret borosilikatglas kapillarrør i en mikropipette aftrækker. Indstil opvarmning for at tillade standard vejede pull til dannelse pipettespids på ca 17,5 mm. Skær tips med skarpe kirurgiske sakse…

Representative Results

Pial overflade elektroporation resulterer i ekspression af plasmid-DNA i celler-meste progenitorer-ved eller nær pial flade 6. Mere specifikt orienteringen af ​​elektroderne er kritisk i dikterer retningen af ​​plasmid bevægelse og efterfølgende ekspression. Således i dobbelt elektrode konfigurationer plasmidet rettet i nogenlunde lige vektor mellem den negative og den positive elektrode. Derfor, hvis den negative pol er placeret over injektionsstedet og den positive pol er ventral til den negativ…

Discussion

Det mest kritiske aspekt for en vellykket elektroporering af pial overflade progenitorer er: 1) målretning af plasmid mix pial overflade; 2) at undgå dannelse af hæmatomer på injektionsstedet; og 3) at undgå dødelighed forbundet med midthjernen elektroporation.

Tilstrækkeligt målretning pial overflade opnås ved målte og omhyggelig punktering af kraniet for at undgå indtrængning af pial overflade. Forkert målretning til den overliggende hud eller underliggende ventrikel eller hje…

Materials

Item Name	Vendor	Catalog Number
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09