Nanopodia - 세포 이동 및 세포 간 상호 작용의 역할로 얇고 깨지기 쉬운 막 계획
Summary
Nanopodia 셀의 전면을 선행 또는 후행 후면에서 100 μM까지 확장하고 세포 환경을 감지 얇고 깨지기 쉬운 막 채널입니다. 37 ° C에서, 부드러운 세정, 에탄올, 메탄올, 아세톤과 같은 유기 용매의 방지에 높은 트리톤 X-100 농도의 직접 고정 이러한 세포 구조를 관찰해야합니다.
Abstract
문화에 부착 세포 이동 및 세포 간 상호 작용을 지원하기 위해 편광 상태를 유지한다. Nanopodia는, 얇은 긴, TM4SF1 (횡단-4-L-여섯 가족 1) 면역 형광 염색을 통해 시각화 할 수있는 내피 세포와 암 세포에서 주로 F-액틴 음성 막 전망이다. 100 ~ 300 μm의 직경 TMED에서 TM4SF1 클러스터 많은 14 개별 TM4SF1 분자에 3을 포함 (TM 4SF1 전자가 마이크로 D omains을 nriched). TMED는 1 μ의 m 당 TMED 3 단단히 행렬에 nanopodia 앵커의 일정한 간격으로 nanopodia 따라 간헐적으로 배치되어있다. 이 편광 내피 또는 종양 세포의 전면을 선행 또는 후행 후면에서 100 개 이상의 μ m를 확장 할 nanopodia을 가능하게하고, MATR에 남아 수 막 잔류의 원인이IX 세포가 멀리 이동하면. TMED 및 nanopodia 때문에 자신의 극단적 인 취약성 및 온도에 대한 민감도 간과되었다. 일상적인 세척 및 고정이 구조를 방해. Nanopodia는 염색 전에 0.01 % 트리톤 X-100에 대한 간단한 노출 한 후, 37 ° C에서 파라 포름 알데히드 (PFA)에 직접 고정하여 유지됩니다. 세포 생물학의 새로운 풍경을 열어 Nanopodia : 그들은 감지하고 거리에서 다른 세포를 식별, 가까운 접촉에서 세포 간 상호 작용을 시작하고, 운동 확산에 관련된 신호 전달 메커니즘, 세포가 자신의 환경을 감지하는 방법에 대한 우리의 이해를 바꿀, 세포 약속 세포 통신. TM4SF1 파생 nanopodia을 연구 개발하는 방법은 고전적인 tetraspanins, 특히 재하 표현 CD9, CD81, 및 CD151의 기관을 통해 다른 세포 유형에 형성 nanopodia의 연구에 유용 할 수 있습니다.
Introduction
운동을위한 편광 동안, 동물 세포는 filopodia, lamellipodia는 후퇴 섬유, 프릴 1 포함한 표면에서 동적, 막 돌기의 다양한 확장합니다. 최근이 목록에 추가 nanopodia, 얇은의 새로 인식 형 (직경 100 ~ 300 μm의), 같은 filopodia 같은 F-액틴 구조의 확장을위한 막 채널을 제공 연장 (최대 50 ~ 100 μm의 길이) 막 투영했다 과 후퇴 섬유, 그리고 얼룩 긍정적 TM4SF1 (횡단-4-L-여섯 가족 1) 배양 된 내피 세포와 종양 세포 2,3에와.
TM4SF1 원래 분자가 내피 세포의 증식과 이주 2,3에서 필수적인 역할을 내피 세포 바이오 마커이다 발견하기 전에 종양 세포 항원 4 알려진 tetraspanin 같은 토폴로지 단백질이다. 면역 형광 염색 TM4SF1가 perinuc하는 지역화 된 것으로 나타났다리어 소포와 세포막에, 그리고는 TM 4SF1 전자 nriched 마이크로 D omains (TMED)에 충실. TMED 앵커 매트릭스 nanopodia 및 nanopodia 1-3 TMED / μm의 길이의 정기적 간격 줄무늬 패턴에 존재. Nanopodia는 일반적으로 세포의 주요 전방에서 연장 운동을위한 세포 편광 동안 뒤 후행. 때문에 TMED의 회사 부착 특성으로 nanopodia는 멀리 이동할 때 셀에 다시 철회 할 수 없습니다; 버려진 nanopodia 잔기 따라서 셀룰러 이동 경로를 추적. F-액틴 확장과 후퇴 막 채널을 제공하고, 세포 간 상호 작용 및 통신 2,3의 사이트는 Nanopodia. 이러한 특성은 세포의 양극화, 환경의 휴대 감지, 세포 운동의 경로와 방향을 결정하고, 세포 간 상호 작용을하는 동안 F-액틴 어셈블리를 기본 메커니즘을 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공 nanopodia 의미차 통신.
때문에 TMED의 소수성이 강한 성격과 nanopodia의 얇고 깨지기 쉬운 막 자연에 특별한주의는 TMED 및 nanopodia을 유지하기 위해 수행해야합니다. nanopodia 및 일반 실험실 방법으로 TMED 제거의 파괴는 예순셋 출판물은 1986 년에 처음 발견 이후와에 100 ~ 300 μm의 마이크로 도메인에서 TM4SF1 농축 지식의 완전한 부족 TM4SF1에 출연 한 이유 가능한 이유 세포 표면 2009/05/02에있는 내피 세포에서 TM4SF1의 보고서까지.
기존의 면역 염색 방법은 일반적으로 세포를 고정하고 세포에게 5 투과 0.1 % 이상 트리톤 X-100의 농도를 사용하는 에탄올, 메탄올, 아세톤과 같은 유기 용매를 사용합니다. (내가) 37 ° C 4 % PFA를 사용하고 37 세포를 수정 : 여기에 설명 된 연구는 TMED 및 nanopodia가 공개하는 종래의 방법으로 세 가지 주요 변경 사항을 구현76, C 인큐베이터, (II) 부드러운 실내 온도 PBS 세척을 적용, 그리고 (iii) 트리톤 X-100은 트리톤 X-100 0.03 %보다 높은 추출하므로, 일차 항체를 첨가하기 전에 세포를 투과하기 위해 잠깐 동안 만 0.03 % 이하를 사용 TM4SF1.
모든 tetraspanins는 세포막 06 마이크로 도메인을 형성하고 일부는 내피 세포 및 종양 세포에서 2,3 TMED로 colocalize. CD9, CD81, CD151과 같은 tetraspanins이 재하 표현되는 바와 같이, 여기에 기재된 염색 프로토콜 nanopodia 기능 연구에 TM4SF1 부족 많은 다른 세포 유형으로 확장 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia 단단히 TMED을 통해 매트릭스에 부착 환경을 감지하고 세포 간 상호 작용 2,3을 중재 할 수있는 편광 모바일 휴대에서 100 개 이상의 μM을 확장 할 수 있습니다 얇은 세포막 채널입니다. 그래서 제대로 잔기가 멀리 이동함에 따라 셀 남아 있는지 매트릭 밀착 Nanopodia (도 1 및 2). Nanopodia 따라서 우리는 세포가 자신의 환경을 감지하는 방법을 연구하고 세포의 이…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 37 ° C PFA에 고정을 시도하는 제안을 포함하여 도움이 토론 박사 해롤드 드보락을 인정합니다. 이 작품은 NIH 보조금 P01의 CA92644에 의해 암 연구를위한 국립 재단의 계약에 의해 지원되었다.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
Referências
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