Nanopodia - Тонкие, хрупкие Мембранные Прогнозы с ролями в сотовых передвижении и межклеточных взаимодействий
Summary
Nanopodia тонкие, но хрупкие мембранные каналы, которые простираются до 100 мкм от переднего фронта или задней задней ячейки и чувств сотовой среды. Прямая фиксация при 37 ° С, нежной стирки, и избежания органических растворителей, таких как этанол, метанол или ацетон и более высоких концентраций Тритон Х-100, должны соблюдать эти клеточные структуры.
Abstract
Приверженец клетки в культуре поддерживать поляризованное состояние, чтобы поддержать движение и межклеточных взаимодействий. Nanopodia тонкие, удлиненные, в значительной степени F-актин-отрицательных мембранные выступы в эндотелиальных и раковых клеток, которые могут быть визуализированы с помощью TM4SF1 (Трансмембранное-4-L-шесть-семья-1) окрашивания иммунофлюоресценции. TM4SF1 кластеры в 100-300 диаметром мкм Tmed (ТМ 4SF1 е nriched микро D omains), содержащий от 3 до целых 14 отдельных TM4SF1 молекул. Tmed расположены прерывисто вдоль nanopodia на очередной интервал от 1 до 3 Tmed за μ м и прочно закрепить nanopodia в матрице. Это позволяет nanopodia расширить более 100 μ м от переднего фронта или задней задней поляризованных эндотелиальных или опухолевых клеток, и вызывает мембранные остатки, чтобы их оставили позади на MATRIX, когда клетка отходит. Tmed и nanopodia были упущены из-за их крайней хрупкости и чувствительности к температуре. Регулярное мытье и фиксация нарушают структуру. Nanopodia сохраняются путем непосредственного фиксации в параформальдегида (PFA) при 37 ° С с последующим короткой инкубации в 0,01% Triton X-100 перед окрашиванием. Nanopodia открыть новые перспективы в области клеточной биологии: они обещают, чтобы изменить наше понимание того, как клетки воспринимают окружающую их среду, обнаруживать и идентифицировать другие клетки на расстоянии, инициировать межклеточных взаимодействий в тесном контакте, и из сигнальных механизмов, участвующих в движении, пролиферации и клеточной -клеточные коммуникации. Методы, разработанные для изучения TM4SF1 производный nanopodia могут быть полезны для изучения nanopodia, которые образуют в других типах клеток посредством классических tetraspanins, в частности с повсеместно выражается CD9, CD81, CD151 и.
Introduction
Во время поляризации для движения, клетки животных расширить разнообразные динамические, мембранные выступы из их поверхности, в том числе филоподий, ламеллиподий, отвода волокон, и оборками 1. Недавно добавленные в этот список были nanopodia, недавно признанным тип тонкий (100-300 мкм в диаметре), удлиненные (длиной до 50-100 мкм) мембраны проекция, которые обеспечивают мембранные каналы для расширения F-актиновых структур, таких как филоподий и отвод волокна, и что пятно положительно с TM4SF1 (трансмембранного-4-L-шесть семьи-1) в культивируемых эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3.
TM4SF1 представляет собой белок с tetraspanin, как топологии, который был первоначально известен как антигеном опухолевых клеток 4 до открытия, что молекула эндотелиальных биомаркеров клеток, что играет существенную роль в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции 2,3. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что TM4SF1 локализуется в perinucLear пузырьки и в плазматическую мембрану, и обогащен ТМ 4SF1 электронных nriched микро г omains (Tmed). Tmed якорь nanopodia к матрице и присутствует в регулярно расположенные Banded рисунком 1-3 длины Tmed / мкм из nanopodia. Nanopodia обычно простираются от переднего фронта клетки и конце задней течение поляризации клеток для движения. В связи с твердым приверженцем природы Tmed, nanopodia не в состоянии отказаться обратно в камеру, как она движется в сторону; брошенные остатки nanopodia таким образом проследить путь сотовой движения. Nanopodia обеспечить мембранные каналы для F-актина выдвижения и втягивания, и являются местами межклеточных взаимодействий и коммуникаций 2,3. Эти характеристики означают, что nanopodia предоставляют уникальную возможность для изучения механизмов, лежащих F-сборку актина во время клеточного поляризации, клеточном зондирования окружающей среды, определения пути и направления движения клеток и межклеточных взаимодействийй коммуникации.
В связи с высокой гидрофобной природы Tmed и тонкой и хрупкой мембранного природы nanopodia, особое внимание должно быть принято в целях сохранения Tmed и nanopodia. Разрушение nanopodia и удаления Tmed по распространенных методов лабораторных является возможная причина, почему только шестьдесят три публикации появились на TM4SF1 с момента своего первого открытия в 1986 1 и для полного незнания TM4SF1 обогащения в 100-300 мкм микродоменов на клеточной поверхности до доклада TM4SF1 в эндотелиальных клетках в 2009 году 2.
Обычные методы иммунным окрашиванием обычно используют органические растворители, как этанол, метанола, ацетона или исправить клетки и используют 0,1% или более высокую концентрацию Triton X-100 в проницаемыми клеткам 5. Исследования, описанные здесь реализуется три основных изменения с обычным способом выявить Tmed и nanopodia: (я) использовать 37 ° C 4% PFA и исправить клеток в 3776; C инкубатор, (II) нежный комнатной температуры стирки PBS, и (III) используют менее 0,03% Triton X-100 только кратко проницаемыми клетки перед добавлением первичного антитела, как Triton X-100 выше, чем 0,03% извлечет TM4SF1.
Все tetraspanins образуют микродомены на клеточной мембране 6 и некоторые локализуются с Tmed в эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3. Как tetraspanins как CD9, CD81, CD151 и экспрессируются повсеместно, протокол окрашивания описанный здесь, может быть продлен до многих различных типов клеток, которые не имеют TM4SF1 для исследований функции nanopodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia тонкие клеточной мембраны каналы, которые прочно прикрепить к матрице через Tmed и может расширить более 100 мкм от поляризованного мобильного клетки ощутить окружающую среду и посредником межклеточные взаимодействия 2,3. Nanopodia придерживаться матрицы так прочно, что остатки ос…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, Д-р Гарольд Дворжака за полезные обсуждения в том числе по предложению попробовать фиксацию в 37 ° C PFA. Эта работа была поддержана NIH грант P01 CA92644 и договором с Национальным фондом по исследованию рака.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
Referências
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
