कैंसर सेल आक्रमण करने के लिए आवेदन के साथ ट्यूमर Stromal microenvironment के ऊतक इंजीनियरिंग
Summary
ऊतक इंजीनियर fibroblast व्युत्पन्न देशी मैट्रिक्स उपकला सेल प्रसार और भेदभाव का समर्थन करता है जो एक स्ट्रोमल सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए एक उभरते उपकरण है. यहाँ ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान पर अलग stromal सेल प्रकार के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस पद्धति को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.
Abstract
Mesenchymal कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड एक मैट्रिक्स पर उपकला कोशिकाओं के 3 डी organotypic संस्कृतियों व्यापक रूप से उपकला सेल भेदभाव और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. मैं कोलेजन और / या Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं से व्युत्पन्न मैट्रिक्स पारंपरिक रूप से mesenchymal कोशिकाओं (आमतौर पर fibroblasts) बसा रहे हैं जिसमें मैट्रिक्स या stromal microenvironment मॉडल पर substrates के रूप में नियोजित किया गया है चूहे की पूंछ प्रकार. ऐसे matrices का उपयोग कर प्रयोगों बहुत जानकारीपूर्ण रहे हैं, यह तर्क दिया जा सकता है कि कारण (इस प्रकार मैं कोलेजन के रूप में) एक प्रोटीन या तहखाने झिल्ली घटकों और माउस से व्युत्पन्न मैट्रिक्स में के रूप में वृद्धि कारकों (के एक उच्च सामग्री की एक अधिभावी उपस्थिति को सार्कोमा कोशिकाओं), इन substrates सबसे अच्छा stromal कोशिकाओं को खुद के द्वारा किए गए मैट्रिक्स संरचना करने के लिए योगदान को प्रतिबिंबित नहीं करते. एक ट्यूमर होने का खतरा, आनुवंशिक blistering विकार (हटने dystrophic साथ रोगियों से अलग प्राथमिक त्वचीय fibroblasts द्वारा उत्पादित देशी matrices का अध्ययन करने के लिएबाह्यत्वचालयन bullosa), हम ट्यूमर सेल आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक मौजूदा देशी मैट्रिक्स प्रोटोकॉल ढाल लिया है. Fibroblasts संस्कृति में एक लम्बी अवधि में अपने स्वयं के मैट्रिक्स का उत्पादन करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. यह देशी मैट्रिक्स तो संस्कृति पकवान से अलग है और पूरे coculture हवा तरल इंटरफेस के लिए उठाया है पहले उपकला कोशिकाओं पर यह वरीयता प्राप्त हैं. सेलुलर भेदभाव और / या आक्रमण तो समय पर मूल्यांकन किया जा सकता है. इस तकनीक को ही नुकसान देशी मैट्रिक्स का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय की लंबी अवधि होने के साथ एक कृत्रिम या विदेशी मैट्रिक्स के लिए आवश्यकता के बिना एक 3 डी की स्थापना में उपकला-mesenchymal सेल बातचीत का आकलन करने की क्षमता प्रदान करता है. यहाँ हम ट्यूमर सेल आक्रमण को बाधित करने fibroblasts द्वारा व्यक्त एक अणु की क्षमता, प्रकार सातवीं कोलेजन, का आकलन करने के लिए इस तकनीक का आवेदन का वर्णन.
Introduction
3 डी टिशू कल्चर में biomaterial का उपयोग 2D आसंजन और एक प्लास्टिक सब्सट्रेट के साथ recapitulated एक की तुलना में एक vivo में पर्यावरण के सदृश शारीरिक शर्तों के तहत प्रयोगशाला में कोशिका व्यवहार का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है. विशेष रूप से, काफी प्रगति आगे हवा तरल इंटरफेस 1-4 पर 3 डी संस्कृति तरीकों को अपनाने के साथ स्तरीकृत epithelia मॉडलिंग में किया गया है. इस तरह की तकनीक ईमानदारी keratinocyte भेदभाव और इन प्रक्रियाओं का अध्ययन के लिए शोधकर्ताओं ने अधिक से अधिक लचीलापन और निष्ठा को सक्षम करने के ट्यूमर सेल आक्रमण की नकल. स्ट्रोमल पर्यावरण नकल करने biomaterial सब्सट्रेट का चुनाव मुख्य रूप से मैं कोलेजन टाइप, Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स और de-epidermized डर्मिस का उपयोग शामिल किया गया है. उदाहरण के लिए, कैंसर से जुड़े fibroblasts स्ट्रोमल उपकला बातचीत 6,7 के माध्यम से कैंसर आक्रमण 5, दीक्षा, और प्रगति की ओर योगदान दिखाया गया है when इस तरह substrates में उगाई.
त्वचा में stromal वातावरण नकल उतार के लिए सोने के मानक, इस तरह की तकनीक का उपयोग सबसे बड़े और सबसे व्यापक रूप से अध्ययन स्तरीकृत epithelia, मानव डर्मिस (DED) de-epidermized माना जाता है. Ded के तैयारी मानव शव त्वचा 3,4 से trypsinization या शारीरिक विसंघटन के माध्यम से epidermis के हटाने शामिल है. हालांकि, इस तरह के त्वचा के लिए उपयोग चिकित्सीय संस्थानों के साथ जुड़ा नहीं की प्रयोगशालाओं के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है, और रोगग्रस्त डर्मिस प्राप्त करने के लिए लगभग असंभव है. एक विकल्प के रूप में, प्रयोगशालाओं अक्सर मैं कोलेजन (चूहे की पूंछ से अलग) और / या Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स प्रकार का एक संयोजन का उपयोग करें.
कि कोलेजन 8 Nageotte द्वारा 1927 में खोज की आसानी एसिटिक एसिड और नमक वर्षा का उपयोग कर अलग किया जा सकता है के बाद, टिशू कल्चर के लिए अपने आवेदन बाद में Huzel ने बीड़ा उठायाला और उनके सहयोगियों ने 9. कोलेजन कोटिंग EHRMANN और Gey 9 से पूछताछ के रूप में 29 उपभेदों और ऊतक explants के सेल संस्कृति के लिए कांच से बेहतर साबित हुई. वर्तमान में, टिशू कल्चर में इस्तेमाल किया कोलेजन के प्रमुख प्रकार चूहा पूंछ tendons से अलग है, और आमतौर पर वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा है. हालांकि, वफादार सब्सट्रेट आवृत्ति के लिए दोष चूहे की पूंछ कोलेजन मानव कोलेजन, या प्रकार मैं और III कोलेजन प्रमुख घटक के रूप में मौजूद हैं, जहां मानव डर्मिस, के समान नहीं है, और अलग चूहे की पूंछ कोलेजन सदा ही खंडित है.
Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स सुसंस्कृत Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं 10 से स्रावित एक पतला प्रोटीन मिश्रण है. प्रमुख घटक laminin, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, हेपरिन सल्फेट proteoglycan, entactin और nidogen हैं और इन प्रोटीनों का सही अनुपात बैच से बैच के लिए अलग अलग होंगे. एक तरफ संरचनात्मक समर्थक सेteins, इस मैट्रिक्स भी इस तरह के विकास का पहलू β, epidermal वृद्धि कारक, इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर 1, गोजातीय fibroblast वृद्धि कारक, और सेलुलर व्यवहार 11,12 बदल जाएगा जो प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक बदलने के रूप में वृद्धि कारकों के महत्वपूर्ण स्तर होते हैं. Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स का सरासर जटिलता की ओर इशारा करते हुए, 1,851 प्रोटीन की कुल हाल ही में एक प्रोटिओमिक अध्ययन 13 में पहचान की गई. व्याख्या और यह 11 के उपयोग के साथ विभिन्न प्रयोगों की तुलना करते समय इस मैट्रिक्स के अमीर और जटिल प्रकृति के प्रकाश में, सावधानी की सलाह दी गई है.
हमारी प्रयोगशालाओं आनुवंशिक त्वचा रोग, त्वचा संबंधी स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (CSCC) 14 के विकास के लिए एक गड़बड़ी के साथ विशेष रूप से उन लोगों में गहरी रुचि है. पीछे हटने dystrophic बाह्यत्वचालयन bullosa (RDEB), COL7A1 जीन में germline परिवर्तन के साथ एक गंभीर blistering रोग के मामले में <s> 15-17 तक, हम इन रोगियों में चमड़े का microenvironment 18 को बढ़ावा देने के ट्यूमर है कि निर्धारित किया है. इस अध्ययन के दौरान हम कोलेजन के भीतर मैं / Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स एम्बेडेड और कोशिकाओं 'दम, देशी मैट्रिक्स का आकलन करने के तरीकों की जांच की त्वचीय fibroblasts के गुणों को बढ़ावा देने के ट्यूमर का आकलन करने में असमर्थ थे. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हम मानव त्वचा पर काम 19,20 समकक्ष लूसी जर्मेन की प्रयोगशाला से पिछले एक तकनीक संशोधित. जर्मेन की तकनीक एक सिंथेटिक या शव का पाड़ के अभाव में प्राथमिक मानव keratinocyte और fibroblast संस्कृतियों का उपयोग अच्छी तरह से संगठित तहखाने झिल्ली के साथ मानव त्वचा को फिर से संगठित करने में सक्षम था.
इस पत्र में त्वचीय ट्यूमर stromal microenvironment (देशी मैट्रिक्स) पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया कदम विट्रो में प्राथमिक stromal fibroblasts से सीधे प्राप्त 18 से वर्णित हैं. निवासी matrices पीfibroblasts की लंबी अवधि संस्कृति से roduced CSCC सेल आक्रमण के लिए परख के बराबर एक चमड़े के रूप में इस्तेमाल किया गया. हम (प्रकार सातवीं कोलेजन (सी 7) में कमी) RDEB fibroblasts द्वारा या retrovirally ट्यूमर पर एक भी कोलेजन का गहरा प्रभाव का निर्माण और प्रदर्शन को व्यक्त एक प्रकार सातवीं कोलेजन के साथ transduced RDEB fibroblasts से स्रावित बाह्य मैट्रिक्स या तो से व्युत्पन्न देशी मैट्रिक्स का उपयोग कर डेटा पेश सेल आक्रमण.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वजह से यह प्रयोग की प्रकृति के पूरा होने के लिए आवश्यक कुल समय दो महीने तक किया जा सकता है. इस समय के दौरान, अत्यंत सावधानी और बाँझ टिशू कल्चर प्रथाओं माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए नियोजित किया ज?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ए पी एस Debra अंतर्राष्ट्रीय और ब्रिटिश त्वचा फाउंडेशन द्वारा समर्थित है. डंडी भागीदारी पीएचडी कार्यक्रम के विश्वविद्यालय – YZN ए स्टार * द्वारा समर्थित है.
Materials
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
| 4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
Referências
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Bioquímica. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- . BD Biosciences – Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , .
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , .
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
