암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학
Summary
조직 공학 섬유 아세포 유래 기본 행렬은 상피 세포의 증식과 분화를 지원하는 기질 기판을 생성하는 새로운 도구입니다. 이곳에서 종양 세포 생물학에 다른 간질 세포 유형의 영향을 평가하기 위하여이 방법을 적용하는 프로토콜이 제시된다.
Abstract
중간 엽 세포를 포함하는 매트릭스에 상피 세포의 3 차원의 Organotypic 문화가 널리 상피 세포의 분화와 침략을 연구하는 데 사용됩니다. I 콜라겐 및 / 또는 Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 세포에서 파생 된 매트릭스는 전통적으로 중간 엽 세포 (일반적으로 섬유 아세포) 채워지로 매트릭스 또는 기질 미세 환경을 모델링하는 기판으로 사용 된 쥐의 꼬리 타입. 이러한 행렬을 사용하여 실험이 매우 유익하지만, 그것은 주장 될 수 인해 (예 타입 I 콜라겐에서와 같이) 하나의 단백질 또는 기저막 성분과 같은 마우스로부터 유도 된 매트릭스와 같은 성장 인자 (높은 함량의 최우선 존재 육종 세포),이 기판은 가장 기질 세포 자체에 의해 매트릭스 조성에 기여를 반영하지 않습니다. 종양이 발생하기 쉬운 유전 적 물집 질환 (열성 이영 환자에서 분리 된 주요 피부 섬유 아 세포에 의해 생성 된 기본 행렬을 연구하는표피 박리증), 우리는 종양 세포의 침공을 연구하는 기존의 기본 매트릭스 프로토콜을 적용했다. 섬유 아 세포 배양에 오랜 기간 동안 자신의 행렬을 생성하도록 유도합니다. 이 기본 행렬은 다음 배양 접시로부터 분리되고 전체 공 배양은 공기 – 액체 계면에 발생하기 전에 상피 세포를 그것에 시딩. 세포 분화 및 / 또는 침입는 시간이 지남에 따라 평가 될 수있다. 이 기술은 유일한 단점은 기본 행렬을 생성하는 데 필요한 시간을 장시간 채로 합성 또는 외국 행렬에 대한 필요없이 3D 설정에서 상피 간엽 세포 상호 작용을 평가하는 능력을 제공한다. 여기에 우리가 종양 세포의 침윤을 억제하는 섬유 아 세포에 의해 표현 된 단일 분자의 기능, 유형 VII 콜라겐을 평가하는이 기술의 응용 프로그램을 설명합니다.
Introduction
3 차원 조직 배양에서 생체 물질의 사용은 2 차원 접착 및 플라스틱 기재로 효과적으로 요약 한보다 생체 내 환경에 더 가깝다 생리적 조건 하에서 실험실에서 세포 행동을 연구하는 연구자 사용할 수있다. 특히, 커다란 진보는 앞으로 공기 – 액체 인터페이스 1-4에서 3 차원 배양 방법의 도입으로 계층화 상피 세포를 모델링되었습니다. 이러한 기술은 충실하게 각질 세포 분화와 이러한 프로세스를 공부하는 연구자에 대한 유연성과 정확도를 가능하게 종양 세포 침입을 모방. 기질 환경을 모방하는 생체 재료 기판의 선택은 주로 I 콜라겐 유형, Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 매트릭스와 디 epidermized 진피의 사용을 포함하고있다. 예를 들어, 암 관련 섬유 아 세포는 각막 상피 상호 작용 6,7를 통해 암 침공 5, 개시 및 진행에 기여하는 것으로 나타났다 갔지N 같은 기판에서 성장.
피부의 기질 환경을 흉내 낸위한 황금 표준은 이러한 기술을 사용하여 가장 크고 가장 널리 연구 층상 상피 세포는 인간의 진피 (DED)를 해제 epidermized 할 간주됩니다. DED의 제조는 인간 사체 피부 3,4에서 트립신 또는 물리적 탈퇴를 통해 표피의 제거를 포함한다. 그러나, 피부에 대한 접근은 임상 기관과 관련이없는 실험실을 위해 매우 어려울 수 있으며, 병 진피 얻을 거의 불가능하다. 대안으로, 실험실 자주 I 콜라겐 (쥐의 꼬리에서 분리) 및 / 또는 Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 매트릭스 타입의 조합을 사용합니다.
그 콜라겐 8 Nageotte에 의해 1927 년 발견 쉽게 아세트산 염 침전을 이용하여 분리 할 수 있습니다 후, 조직 배양에의 응용은 이후 Huzel에 의해 개척되었다라와 동료 9. 콜라겐 코팅은 에르와 Gey 9 심문으로 29 균주 및 조직 절편의 세포 배양을위한 유리에 우수한 것으로 판명되었다. 현재 조직 배양에 사용되는 콜라겐의 주요 유형은 쥐 꼬리, 힘줄에서 고립되고, 일반적으로 상용 소스에서 구입한다. 그러나 충실한 기판 재현부의 단점은 쥐의 꼬리 콜라겐은 인간의 콜라겐, 또는 타입 I과 III 콜라겐이 주요 성분으로 존재하는 인간의 진피, 동일하지 않은, 고립 된 쥐의 꼬리 콜라겐은 변함없이 조각 것입니다.
Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 행렬은 배양 Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 세포 (10)에 의해 분비되는 젤라틴 단백질의 혼합물이다. 주요 성분은 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파린 황산 프로테오글리칸, entactin 및 nidogen하고이 단백질의 정확한 비율은 배치에서 배치에 따라 다를 것입니다. 이외에도 구조 프로에게에서teins,이 행렬은 또한 성장 인자 β, 표피 성장 인자, 인슐린 – 유사 성장 인자 1, 소 섬유 아세포 성장 인자, 및 셀룰러 동작 11,12을 변화시키는 혈소판 유래 성장 인자가 바뀌는 등의 성장 인자의 유의 수준을 포함한다. Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 행렬의 깎아 지른듯한 복잡쪽으로 향하고, 1,851 단백질의 총 최근 프로테오믹스 연구 (13)에서 확인되었다. 해석하고 11의 사용으로 다른 실험을 비교할 때이 행렬의 풍부하고 복잡한 자연의 빛에주의 권고하고있다.
우리의 실험실은 유전 적 피부 질환, 피부 편평 상피 세포 암 (CSCC) 14을 개발하는 경향과 특히에 관심이 있습니다. 열성 이영의 표피 박리증 (RDEB), COL7A1 유전자의 생식 세포 돌연변이 심한 물집이 생기는 질병의 경우 <s> 15 일에서 17 일까지, 우리는 이러한 환자에서 피부의 미세 환경 (18)을 승진 종양이라고 판단했다. 이 연구의 과정에서 우리는 콜라겐 내에서 I / Engelbreth-홀름 – 떼 마우스 육종 행렬을 포함하고 세포의 자신의 네이티브 매트릭스를 평가하는 방법을 조사 피부 섬유 아 세포의 속성을 촉진 종양을 평가 할 수 없습니다. 이를 위해, 우리는 인간의 피부에서 작업하는 19, 20 당량 루시 제르맹의 실험실에서 이전의 기술을 수정했습니다. 제르맹의 기술은 합성 또는 사체 발판의 부재에서 인간의 기본 각질 세포와 섬유 아세포 문화를 사용하여 잘 조직 된 기저막으로 인간의 피부를 재구성 할 수 있었다.
본 논문에서는 피부 종양 기질 미세 환경 (기본 매트릭스)를 요점을 되풀이하는 데 사용되는 단계는 체외에서 기본 간질 섬유 아세포에서 직접 파생는 18에 설명되어 있습니다. 기본 행렬이 P섬유 아 세포의 장기 배양 roduced는 CSCC 세포 침입에 대한 분석에 해당하는 피부로 사용되었다. 우리는 (유형 VII 콜라겐 (C7) 결핍) RDEB 섬유 아세포 또는 retrovirally 종양의 단일 콜라겐의 깊은 효과를 생성하고 보여 표현하는 유형 VII 콜라겐 형질 RDEB 섬유 아세포에서 분비 세포 외 기질 중 하나에서 파생 된 기본 행렬을 사용하여 데이터를 제시 세포 침공.
Protocol
Representative Results
Discussion
때문에 본 실험의 특성상 완료에 필요한 전체 시간은 최대 2 개월 일 수있다. 이 시간 동안, 최대한의주의와 무균 조직 배양 방법은 미생물 오염을 방지하기 위해 사용되어야합니다.
이외에도 하이드 록시 프롤린 및 히드 록시 리신의 콜라겐의 합성에 보조 인자로서의 역할에서, 아스코르브 산 (22)은 섬유 아세포에서 콜라겐 특정 mRNA 발현을 자극…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APS는 데브라 국제 및 영국 피부 재단이 지원됩니다. 던디 파트너십 박사 프로그램의 대학 – YZN는 * STAR에 의해 지원됩니다.
Materials
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
| 4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
Referências
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Bioquímica. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- . BD Biosciences – Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , .
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , .
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
