Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Summary

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Abstract

Molte proteine ​​interagiscono transitoriamente con altre proteine ​​o sono integrati in complessi multi-proteici di svolgere la loro funzione biologica. Bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è un metodo in vivo per monitorare tali interazioni nelle cellule vegetali. Nel protocollo presentato proteine ​​candidate indagati sono fusi a metà complementari di proteine ​​fluorescenti ei rispettivi costrutti vengono introdotti nelle cellule vegetali tramite trasformazione mediata da Agrobacterium. Successivamente, le proteine ​​sono espresse transitoriamente in foglie di tabacco ei segnali fluorescenti restaurati possono essere rilevati con un microscopio confocale a scansione laser nelle cellule intatte. Ciò consente non solo la visualizzazione della stessa interazione, ma anche la localizzazione subcellulare dei complessi proteici può essere determinato. A tal fine, geni marcatori contenenti un tag fluorescente possono essere coexpressed insieme ai costrutti BiFC, visualizzando così strutture cellulari come tegli reticolo endoplasmatico, mitocondri, l'apparato di Golgi o la membrana plasmatica. Il segnale fluorescente può essere monitorato direttamente nelle cellule epidermiche foglia o in protoplasti singoli, che possono essere facilmente isolato dalle foglie di tabacco trasformate. BiFC è ideale per studiare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale all'interno della cellula vivente. Tuttavia, va considerato che l'espressione deve essere comandato da promotori forti e che i partner di interazione sono modificati per effetto fusione dei tag fluorescenza relativamente grandi, che potrebbero interferire con il meccanismo di interazione. Tuttavia, BiFC è un ottimo approccio complementare ad altri metodi comunemente applicati inquirenti interazioni proteina-proteina, come coimmunoprecipitation, vitro saggi di pull-down o esperimenti lievito-two-hybrid.

Introduction

Studiare la formazione di complessi proteici e la loro localizzazione nelle cellule vegetali in vivo è essenziale per indagare reti cellulari, segnalazione e processi metabolici. BiFC permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale direttamente all'interno della cellula vegetale vivente ^1-5.

Nel BiFC avvicinarsi alla complementazione di due frammenti N-e C-terminali non fluorescente di una proteina fluorescente piombo ad una proteina fluorescente ricostituito. Frammenti di molte proteine ​​fluorescenti differenti sono stati utilizzati per rilevare le interazioni proteina, ad esempio, la proteina fluorescente verde (GFP) cromoforo delle quali è formata da tre residui chimicamente distinte ^6. Proteine ​​fluorescenti possono essere dimezzati all'interno di un ciclo o ß-strand di provocare i due frammenti non fluorescente che possono essere fuse per entrambe le proteine ​​di interesse. Il test può essere utilizzato per rilevare le interazioni in qualsiasi compartme subcellularent in qualsiasi organismo aerobicamente crescente o celle che possono essere geneticamente modificato per esprimere le proteine ​​di fusione. Se le due proteine ​​entrano in prossimità all'interno della cellula, la fluorescenza viene ricostituito e può essere monitorato mediante microscopia senza aggiunta di fluorofori esogeni o coloranti ^3.

Tabacco (Nicotiana benthamiana) ha dimostrato di essere un modello conveniente organismo per visualizzare l'interazione di proteine ​​vegetali, poiché le proteine ​​possono facilmente essere espresse utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium di foglie di tabacco con i costrutti generati. Agrobatteri utilizzano un cosiddetto plasmide Ti (cancerogeni) codificanti per enzimi che mediano la trasduzione del gene di interesse in cellule vegetali. BiFC è ben applicabile per solubile così come per le proteine ​​di membrana all'interno di tutti i compartimenti cellulari ed è stato usato con successo negli ultimi anni per identificare proteine ​​interagenti in vivo e analizzare i siti di interazioneall'interno delle proteine ^​​7-9. Su espressione dei geni introdotti, l'interazione delle proteine ​​fluorescenti può essere visualizzato direttamente in foglie, che è adatto per strutture cellulari più grandi, come il reticolo endoplasmatico (ER), la membrana plasmatica o cloroplasti. Tuttavia, per monitorare la localizzazione in strutture più raffinate, per esempio, la busta cloroplasto, si consiglia di visualizzare la fluorescenza in protoplasti isolati di foglie di tabacco trasformate. Un insieme di vettori BiFC contenenti sia un C-terminale o un tag fluorescente N-terminale deve essere utilizzato per l'approccio BiFC in piante ^10. Il protocollo descritto qui di seguito è stato utilizzato per studiare l'interazione di citosolica heat shock protein 90 (HSP90) con la ripetizione tetratricopeptide (TPR) dominio contenente attracco proteine ​​Toc64 e AtTPR7 risiedono nella busta esterna cloroplasto e il reticolo endoplasmatico, rispettivamente, ^11-13. A questo scopo, HSP90 è stata fusa al Ctparte erminal di SCFP (SCFP ^C). Il tag è N-terminale fusa al chaperone per garantire l'accessibilità del C-terminale MEEVD motivo di legame di HSP90 al morsetto di tipo domini TPR. In parallelo, la parte N-terminale di Venere (Venus ^N) è stato fuso con i domini citosolici del dominio TPR contenente attracco proteine ​​Toc64 e AtTPR7, rispettivamente. Come controllo negativo abbiamo clonato la parte C-terminale solubile di SCFP ^C, solamente che risiede nel citosol ed è quindi un controllo appropriato.

I tag fluorescenti delle proteine ​​studiate devono affrontare lo stesso compartimento cellulare per consentire la vicinanza e la ricostituzione del segnale fluorescente in tal modo. Per determinare la localizzazione del segnale fluorescente ricostituito una proteina marker fusa a un tag fluorescente differente può essere cotransformed per dimostrare la localizzazione subcellulare dell'interazione. Una proteina marker ER fusa mCherrry fu trasformato simultaneamente nellacaso di ER si trova AtTPR7 ^14. L'autofluorescenza della clorofilla servito come marcatore cloroplasto in caso di Toc64. Con questo non solo l'interazione in vivo di Toc64 AtTPR7 e, rispettivamente, con la HSP90 chaperone citosolico può essere monitorato direttamente in foglie di tabacco, ma anche la localizzazione subcellulare dell'interazione può essere indagata.

BiFC è adatto come un approccio complementare ad altri metodi che studiano le interazioni proteina-proteina. Rispetto al coimmunoprecipitation o de esperimenti di pull-down in vitro, per esempio, anticorpi specifici devono essere disponibili per le proteine ​​di interesse, e le proteine ​​non devono essere espresso in modo ricombinante in vitro, che può essere difficile, specialmente per proteine ​​di membrana. Inoltre, anche le interazioni transitori possono essere monitorati utilizzando BiFC, poiché le proteine ​​sono catturate dalla interazione dei tag fluorescenti fusi ^15.

Protocol

1. Trasformazione di BiFC Costruisce in Agrobacteria Clonazione di costrutti BiFC Amplificare il gene di interesse da un modello appropriato utilizzando oligonucleotidi contenenti accompagnamento ATTB siti. Eseguire una PCR utilizzando un polimerasi correzione di bozze. Adattare la lunghezza della fase di ricottura per la combinazione di primer creazione e la lunghezza del passo allungamento secondo la dimensione del frammento. Controllare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio …

Representative Results

In questo esempio si è usato il metodo BiFC per monitorare l'interazione della HSP90 citosolico chaperone molecolare delle proteine ​​di membrana di docking AtTPR7 e Toc64. AtTPR7 fa parte del translocon Sec e interagisce con chaperone citosolico, che eventualmente offrono preproteine ​​secretori per traslocazione post-traduzionale alla membrana ER. Allo stesso modo, Toc64 la busta esterna cloroplasto agisce in import post-traslazionale ricevendo HSP90 preproteine ​​cloroplasti associati. Entrambe le pr…

Discussion

Dopo la pianificazione di un esperimento BiFC devono essere considerati diversi punti. Nonostante non sia richiesta informazioni strutturali sulle proteine ​​di interesse, la topologia deve essere conosciuto quando si lavora con proteine ​​di membrana spanning. Le proteine ​​fluorescenti devono risiedere nello stesso compartimento subcellulare o affrontare lo stesso lato di una membrana per consentire l'interazione. Naturalmente, quando si analizzano le proteine ​​che richiedono una sequenza di targe…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)