तंबाकू protoplasts और पत्तियों में Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation द्वारा कल्पना प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत
Summary
Vivo में प्रोटीन परिसरों के गठन bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक द्वारा देखे जा सकते हैं. बातचीत भागीदारों फ्लोरोसेंट टैग के पूरक भागों में जुड़े हुए हैं और क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त, दो प्रोटीनों के करीब निकटता पर एक पुनर्गठन फ्लोरोसेंट संकेत के परिणामस्वरूप कर रहे हैं.
Abstract
कई प्रोटीन अन्य प्रोटीन के साथ क्षणिक बातचीत या उनके जैविक समारोह में प्रदर्शन करने के लिए बहु – प्रोटीन परिसरों में एकीकृत कर रहे हैं. Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC) संयंत्र कोशिकाओं में इस तरह की बातचीत की निगरानी के लिए एक Vivo में विधि है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल में जांच उम्मीदवार प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पूरक हिस्सों से इनकार कर रहे हैं और संबंधित निर्माणों Agrobacterium की मध्यस्थता परिवर्तन के माध्यम से संयंत्र कोशिकाओं में पेश कर रहे हैं. बाद में, प्रोटीन क्षणिक तम्बाकू के पत्ते में व्यक्त कर रहे हैं और बहाल फ्लोरोसेंट संकेतों बरकरार कोशिकाओं में एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग से पता लगाया जा सकता है. इस बातचीत के ही केवल नहीं दृश्य की अनुमति देता है, लेकिन यह भी प्रोटीन परिसरों के subcellular स्थानीयकरण निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रयोजन के लिए, एक फ्लोरोसेंट टैग युक्त मार्कर जीन इस प्रकार इस तरह के टी के रूप में सेलुलर संरचनाओं visualizing, BiFC निर्माणों के साथ coexpressed किया जा सकता हैवह जालिका, mitochondria, Golgi उपकरण या प्लाज्मा झिल्ली endoplasmic. फ्लोरोसेंट संकेत या तो सीधे एपिडर्मल पत्ता कोशिकाओं में या आसानी से बदल तम्बाकू के पत्ते से अलग किया जा सकता है, जो एक protoplasts में नजर रखी जा सकती है. BiFC आदर्श जीवित कोशिका के भीतर अपने प्राकृतिक परिवेश में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. हालांकि, यह अभिव्यक्ति मजबूत प्रमोटरों द्वारा संचालित किया जाना है और बातचीत के भागीदारों के कारण बातचीत तंत्र के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो अपेक्षाकृत बड़ा प्रतिदीप्ति टैग, के विलय को संशोधित कर रहे हैं कि उस पर विचार किया जाना है. फिर भी, BiFC ऐसे coimmunoprecipitation के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत,, इन विट्रो पुल से नीचे assays या खमीर दो संकर प्रयोगों की जांच अन्य सामान्य रूप से लागू किया तरीकों के लिए एक उत्कृष्ट पूरक दृष्टिकोण है.
Introduction
प्रोटीन परिसरों के गठन का अध्ययन करने और इन विवो में संयंत्र कोशिकाओं में उनके स्थानीयकरण सेलुलर नेटवर्क की जांच के लिए आवश्यक है, संकेत और चयापचय की प्रक्रिया. BiFC सीधे रहने वाले संयंत्र सेल 1-5 भीतर उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति देता.
BiFC में एक पुनर्गठन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन नेतृत्व की दो nonfluorescent एन और सी टर्मिनल टुकड़े के पूरक दृष्टिकोण. कई अलग अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के टुकड़े हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) रासायनिक तीन अलग अवशेषों 6 द्वारा बनाई है जिनमें से क्रोमोफोर जैसे, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज की दोनों प्रोटीन से इनकार किया जा सकता है जो दो nonfluorescent टुकड़ों में परिणाम के लिए एक पाश या एसएस किनारा भीतर आधा किया जा सकता. परख किसी भी subcellular compartme में बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैआनुवंशिक रूप से संलयन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है कि किसी भी aerobically बढ़ रही जीव या कोशिकाओं में NT. दो प्रोटीन कोशिका के भीतर करीब निकटता में आते हैं, प्रतिदीप्ति का पुनर्गठन कर रहा है और exogenous fluorophores या रंजक 3 के अलावा बिना माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है.
प्रोटीन आसानी से तंबाकू उत्पन्न निर्माणों के साथ पत्तियों का Agrobacterium की मध्यस्थता परिवर्तन के उपयोग के द्वारा व्यक्त किया जा सकता है क्योंकि तंबाकू (निकोटियाना benthamiana), संयंत्र प्रोटीन की बातचीत कल्पना करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल जीव साबित हो गया है. Agrobacteria संयंत्र कोशिकाओं में ब्याज की जीन के पारगमन कि मध्यस्थता एंजाइमों के लिए कोडिंग एक तथाकथित तिवारी प्लाज्मिड (ट्यूमर उत्प्रेरण) का उपयोग करें. BiFC घुलनशील के लिए और साथ ही सभी सेलुलर डिब्बों के भीतर झिल्ली प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से लागू है और सफलतापूर्वक vivo में प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के साथ ही बातचीत साइटों का विश्लेषण करने के लिए पिछले वर्षों में इस्तेमाल किया गया है7-9 प्रोटीन के भीतर. पेश जीनों की अभिव्यक्ति पर, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की बातचीत ऐसे जालिका (ईआर), प्लाज्मा झिल्ली या क्लोरोप्लास्ट के रूप में बड़ा सेलुलर संरचनाओं, के लिए उपयुक्त है, जो पत्तियों में सीधे देखे जा सकते हैं. हालांकि, अधिक परिष्कृत संरचनाओं में स्थानीयकरण नजर रखने के लिए, उदाहरण के लिए, क्लोरोप्लास्ट लिफाफा, यह बदल तम्बाकू के पत्ते से अलग protoplasts में प्रतिदीप्ति कल्पना करने की सलाह दी जाती है. एक सी टर्मिनल या एक एन टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग पौधों 10 में BiFC दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जाना है जिसमें या तो BiFC वैक्टर का सेट. इसके बाद वर्णित प्रोटोकॉल tetratricopeptide दोहराने डॉकिंग प्रोटीन Toc64 और AtTPR7 क्लोरोप्लास्ट बाहरी लिफाफा और क्रमशः जालिका, 11-13 में रहने से युक्त (TPR) डोमेन के साथ साइटोसोलिक गर्मी झटका प्रोटीन 90 (HSP90) की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए HSP90 सीटी इनकार किया गया थाSCFP (SCFP सी) के erminal हिस्सा. टैग एन टर्मिनली TPR डोमेन प्रकार दबाना HSP90 के सी टर्मिनल MEEVD बाध्यकारी आकृति की पहुंच सुनिश्चित करने के लिए निगरानी इनकार किया गया था. समानांतर में, वीनस (शुक्र एन) के एन टर्मिनल हिस्सा डॉकिंग प्रोटीन क्रमशः Toc64 और AtTPR7, जिसमें TPR डोमेन की साइटोसोलिक डोमेन इनकार किया गया था. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में हम cytosol में रहता है और इसलिए एक उचित नियंत्रण है जो केवल SCFP सी के घुलनशील सी टर्मिनल हिस्सा क्लोन.
अध्ययन प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैग करीब निकटता और इस तरह फ्लोरोसेंट संकेत के पुनर्गठन की अनुमति के लिए एक ही सेलुलर डिब्बे का सामना करना पड़ेगा. एक अलग फ्लोरोसेंट टैग के लिए जुड़े हुए एक मार्कर प्रोटीन बातचीत की subcellular स्थानीयकरण प्रदर्शित करने के लिए cotransformed जा सकता पुनर्गठन फ्लोरोसेंट संकेत का स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए. MCherrry से जुड़े हुए एक ईआर मार्कर प्रोटीन में एक साथ बदल गया थाAtTPR7 14 स्थित ईआर के मामले. क्लोरोफिल के autofluorescence Toc64 के मामले में क्लोरोप्लास्ट मार्कर के रूप में सेवा की. ऐसा करके न केवल साइटोसोलिक HSP90 निगरानी के साथ क्रमशः Toc64 और AtTPR7, के vivo बातचीत तम्बाकू के पत्ते में सीधे नजर रखी जा सकती है, लेकिन यह भी बातचीत की subcellular स्थानीयकरण की जांच की जा सकती है.
BiFC अच्छी तरह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन अन्य तरीकों के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में उपयुक्त है. Coimmunoprecipitation करने या इन विट्रो पुल से नीचे प्रयोगों में तुलना में, उदाहरण के लिए, कोई विशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटीन के हित के लिए उपलब्ध रहना होगा, और प्रोटीन विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो recombinantly विट्रो में व्यक्त किया जा की जरूरत नहीं है. प्रोटीन जुड़े हुए फ्लोरोसेंट टैग 15 की बातचीत के द्वारा कब्जा कर रहे हैं, क्योंकि इसके अलावा, यह भी क्षणिक बातचीत, BiFC उपयोग पर नजर रखी जा सकती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक BiFC प्रयोग की योजना बना करने पर कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए. ब्याज की प्रोटीन के बारे में कोई जानकारी संरचनात्मक आवश्यक है, टोपोलॉजी झिल्ली फैले प्रोटीन के साथ कार्य करते समय ज्ञात किया जाना ह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए उपयोगी विचार विमर्श और क्रिस कैरी के जुरगेन Söll धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना DFG और Fonds der chemischen इंडस्ट्री (अनुदान संख्या SFB 1035, एस एस के लिए परियोजना A04 रुपये से 187/22 मत) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
Referências
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