Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Summary

Dannelse av protein komplekser in vivo kan visualiseres ved bimolecular fluorescens complementation. Interaksjonspartnere er smeltet sammen til komplementære deler av fluoriserende koder og forbigående uttrykt i tobakksblader, som resulterer i et rekonstituert fluorescerende signal på tett nærhet av de to proteiner.

Abstract

Mange proteiner samhandle forbigående med andre proteiner, eller er integrert i multiproteinkomplekser å utføre sin biologiske funksjon. Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en in vivo metode for å overvåke slike interaksjoner i planteceller. I den fremlagte protokoll de undersøkte kandidat proteiner er fusjonert til komplementære halvdeler av fluorescerende proteiner og de respektive konstruksjoner innføres i planteceller via Agrobacterium-formidlet transformasjon. Deretter blir proteinene forbigående uttrykt i tobakksblader, og de gjenopprettede fluorescerende signaler kan detekteres med en konfokal laser scanning mikroskop i intakte celler. Dette tillater ikke bare visualisering av interaksjonen seg selv, men også den subcellulære lokalisering av proteinkomplekser kan bestemmes. For dette formål kan markørgener inneholdende et fluoriserende kode kan coexpressed sammen med BiFC konstruksjoner, og dermed å visualisere cellulære strukturer som for eksempel tHan endoplasmatiske retikulum, mitokondrier, Golgi-apparatet eller plasmamembranen. Det fluorescerende signalet kan overvåkes enten direkte i epidermale celler blad eller i enkle protoplaster, som lett kan isoleres fra de transformerte tobakksblader. BiFC er ideell for å studere protein-protein interaksjoner i sine naturlige omgivelser i den levende celle. Imidlertid må det tas i betraktning at uttrykket må være drevet av sterke promotorer, og at interaksjonspartnere er modifisert på grunn av sammensmelting av de forholdsvis store fluorescens-koder, noe som kan forstyrre interaksjonen mekanisme. Likevel er BiFC en utmerket komplementær tilnærming til andre vanlig anvendte metoder undersøker protein-protein interaksjoner, for eksempel coimmunoprecipitation, in vitro pull-down analyser eller gjær-to-hybrid eksperimenter.

Introduction

Studerer dannelsen av protein komplekser og deres lokalisering i planteceller in vivo er viktig å undersøke mobilnettverk, signal og metabolske prosesser. BiFC tillater visualisering av protein-protein interaksjoner i sitt naturlige miljø direkte i levende plantecelle ^1-5.

I BiFC nærmer komplementering av to nonfluorescent N-og C-terminale fragmenter av et fluorescerende protein fører til et rekonstituert fluorescerende protein. Fragmenter av mange forskjellige fluorescerende proteiner har blitt brukt for å påvise protein interaksjoner, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) chromophore som er kjemisk dannet av tre forskjellige rester ^6. Fluorescent proteiner kan halveres i en løkke eller ß-tråd for å føre de to nonfluorescent fragmenter som kan bli sammensmeltet til både proteiner av interesse. Målingen kan brukes til å detektere vekselvirkninger i en hvilken som helst subcellulære kupént i en hvilken som helst aerobt voksende organismer eller celler som kan bli genetisk modifisert for å uttrykke fusjonsproteiner. Hvis de to proteinene kommer til tett nærhet i cellen, blir fluorescens rekonstituert og kan overvåkes ved mikroskopi uten tilsetning av eksogene fluoroforer eller fargestoffer ^3.

Tobakk (Nicotiana benthamiana) har vist seg å være en praktisk modellorganisme for å visualisere samspillet mellom planteproteiner, siden proteiner kan lett komme til uttrykk ved å utnytte agrobacterium-mediert transformasjon av tobakk blader med de genererte konstruksjoner. Agrobacteria bruke en såkalt Ti-plasmid (tumorinduserende) som koder for enzymer som medierer den transduksjon av genet av interesse inn i planteceller. BiFC er anvendelig også for løselige så vel som for membranproteiner i alle cellene og har vært brukt med hell i de siste årene for å identifisere samspill proteiner in vivo, så vel som for å analysere interaksjon stederinnenfor proteiner ^7-9. Ved ekspresjon av de innførte genene, kan vekselvirkningen mellom de fluorescerende proteiner visualiseres direkte i blader, som er egnet for større cellulære strukturer, slik som det endoplasmatiske retikulum (ER), plasma membran eller kloroplaster. Imidlertid, for å overvåke lokaliseringen i mer raffinerte strukturer, f.eks kloroplast konvolutt, er det tilrådelig å visualisere fluorescens i protoplaster isolert fra transformerte tobakksblader. Et sett med BiFC vektorer inneholdende enten en C-terminal eller en N-terminal fluorescerende merke må brukes for BiFC tilnærming i planter ^10. Den heretter beskrevet protokollen ble brukt til å studere samspillet av cytosoliske heat shock protein 90 (HSP90) med tetratricopeptide gjenta (TPR) domene som inneholder docking proteiner Toc64 og AtTPR7 bosatt i kloroplast ytre konvolutt og det endoplasmatiske retikulum, henholdsvis ^11-13. For dette formål ble HSP90 smeltet til Cterminal del av SCFP (SCFP ^C). Brikken var N-terminalt smeltet til anstand for å sikre tilgjengelighet for den C-terminale MEEVD bindende motivet av HSP90 å klemme-type TPR domener. Parallelt med dette ble den N-terminale del av Venus (Venus ^N) sammensmeltet til de cytosoliske domener av TPR domene som inneholder docking proteiner Toc64 og AtTPR7, respektivt. Som en negativ kontroll vi klonet det oppløselige C-terminale del av SCFP ^C utelukkende som ligger i cytosol og er derfor en passende kontroll.

Fluorescerende tags av de studerte proteinene har for å møte de samme cellulære rommet for å tillate nærhet og dermed tilberedning av fluorescerende signal. For å bestemme lokaliseringen av den rekonstituerte fluorescerende signal på en markør protein kondensert til en annen fluorescerende tag kan kotransformert å demonstrere den subcellulære lokalisering av interaksjonen. En ER markør protein smeltet til mCherrry ble forvandlet samtidig iVed akuttmottaket ligger AtTPR7 ^14. Den autofluorescence av klorofyll fungert som kloroplast markør i tilfelle Toc64. Ved dette ikke bare den in vivo interaksjon av Toc64 og AtTPR7, henholdsvis med den cytosoliske HSP90 anstand kan overvåkes direkte i tobakksblader, men også den subcellulære lokalisering av interaksjonen kan undersøkes.

BiFC er godt egnet som en komplementær tilnærming til andre metoder som studerer protein-protein interaksjoner. Sammenlignet med coimmunoprecipitation eller in vitro-pull-down eksperimenter, for eksempel, ingen spesifikke antistoffer må være tilgjengelig for proteinene av interesse, og proteiner behøver ikke å være rekombinant uttrykt in vitro, noe som kan være vanskelig, særlig for membranproteiner. Videre også forbigående interaksjoner kan overvåkes ved hjelp BiFC, siden proteiner er fanget av et samspill av de smeltet fluorescerende tagger ^15.

Protocol

En. Transformasjon av BiFC Konstruerer i Agrobacteria Kloning av BiFC konstruerer Forsterke genet av interesse fra en passende mal bruker oligonukleotider som inneholder flankerer attB-sider. Utfør en PCR ved hjelp av en korrekturlesing polymerase. Tilpass lengden av glødetrinn til det utformet primer kombinasjon og lengden av forlengelsen trinn i henhold til fragment størrelse. Kontroller PCR produktet ved agarosegelelektroforese og rense den ved hjelp av en PCR Clean-up Kit. Utfør BP …

Representative Results

I dette eksemplet har vi brukt BiFC metode for å overvåke samspillet av cytosoliske molekylære anstand HSP90 med membran docking proteiner AtTPR7 og Toc64. AtTPR7 er en del av Sec translocon og samhandler med cytosoliske anstand, som muligens leverer sekretoriske preproteiner for post-translasjonell translokasjon til ER membranen. Likeledes, Toc64 på kloroplast ytre konvolutt opptrer i post-translasjonell import ved å motta HSP90 forbundet chloroplast preproteiner. Begge proteiner omfatte en cytosoliske eksponert T…

Discussion

Ved planlegging av en BiFC eksperiment flere punkter bør vurderes. Selv om ingen strukturell informasjon om de proteiner av interesse er nødvendig, har topologien til å være kjent når man arbeider med membran som strekker seg over proteiner. De fluorescerende proteiner har til å ligge i samme subcellulære rom eller vender den samme side av en membran for å tillate interaksjon. Naturligvis, ved analyse av proteiner som krever en N-terminal sekvensstyringen, bare en C-terminal-koden kan bli vurdert. Siden det er m…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)