Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Summary

Bildning av protein-komplex in vivo kan visualiseras genom bimolekylära fluorescens komplementering. Interaktionspartner är fuserade till komplementära delar av fluorescerande taggar och uttrycktes transient i tobaksblad, vilket resulterar i en rekonstituerad fluorescerande signal vid närhet av de två proteinerna.

Abstract

Många proteiner interagera transient med andra proteiner eller integreras i multiproteinkomplex för att utföra sin biologiska funktion. Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) är en in vivo-metod för att övervaka sådana interaktioner i växtceller. I den presenterade protokollet de undersökta kandidat proteiner smält till kompletterande halvor av fluorescerande proteiner och respektive konstruktioner introduceras i växtceller via Agrobacterium-medierad omvandling. Därefter är de proteiner som uttrycktes transient i tobaksblad och de återställda fluorescerande signalerna kan detekteras med ett konfokalt lasersvepmikroskop i intakta celler. Detta gör inte bara visualisering av interaktionen, utan även den subcellulära lokaliseringen av de protein-komplex kan bestämmas. För detta ändamål kan markörgener som innehåller en fluorescerande taggen samuttrycks tillsammans med BiFC konstruktioner sålunda visualisera cellulära strukturer såsom than endoplasmatiska retiklet, mitokondrier Golgi-apparaten eller plasmamembranet. Den fluorescerande signal kan övervakas, antingen direkt i epidermala bladceller eller i enkelprotoplaster, vilka lätt kan isoleras från de transformerade tobaksblad. BiFC är idealisk för att studera protein-proteininteraktioner i deras naturliga miljö i den levande cellen. Dock måste det anses att uttrycket måste drivas av starka promotorer och att interaktionspartners modifieras på grund av fusion av de relativt stora fluorescens-taggar, som kan påverka interaktionen mekanismen. Icke desto mindre är BiFC ett utmärkt komplement till andra vanligen tillämpade metoder undersöker protein-proteininteraktioner, såsom coimmunoprecipitation, in vitro-pull-down assays eller jäst-två-hybrid-experiment.

Introduction

Att studera bildningen av proteinkomplex och deras lokalisering i växtceller in vivo är nödvändig för att undersöka cellulära nät, signal-och metaboliska processer. BiFC tillåter visualisering av protein-proteininteraktioner i sin naturliga miljö direkt i levande växtcell ^1-5.

I BiFC närmar komplementering av två icke-fluorescerande N-och C-terminala fragment av ett fluorescerande protein leder till en rekonstituerad fluorescerande protein. Fragment av många olika fluorescerande proteiner har använts för att detektera protein-interaktioner, t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP) kromoforen som är kemiskt bildad av tre distinkta rester ^6. Fluorescerande proteiner kan halveras inom en slinga eller SS-strängen för att resultera i de två icke-fluorescerande fragment, vilka kan vara kondenserade till båda proteinerna av intresse. Analysen kan användas för att upptäcka interaktioner i någon subcellulär fack fyrant på något aerobiskt växande organism eller celler som kan modifieras genetiskt för att uttrycka fusionsproteinerna. Om de två proteinerna komma i omedelbar närhet inom cellen, är fluorescens rekonstitueras och kan övervakas genom mikroskopi utan tillsats av exogena fluoroforer eller färgämnen ^3.

Tobak (Nicotiana benthamiana) har visat sig vara en lämplig modellorganism för att visualisera samspelet av växtproteiner, eftersom proteiner lätt kan uttryckas genom att använda Agrobacterium-medierad omvandling av tobaksbladen med de genererade konstruktioner. Agrobakterier använda en s.k. Ti-plasmid (tumörinducerande) som kodar för enzymer som förmedlar transduktion av den intressanta genen i växtceller. BiFC är väl tillämplig för lösligt såväl som för membranproteiner inom samtliga cellulära avdelningar och har framgångsrikt använts under de senaste åren för att identifiera interagerande proteiner in vivo såväl som för att analysera interaktionsställeninom proteinerna ^7-9. Vid uttryck av de introducerade generna, kan interaktionen mellan de fluorescerande proteinerna visualiseras direkt i bladen, som är lämplig för större cellulära strukturer, såsom det endoplasmatiska retiklet (ER), plasmamembranet eller kloroplaster. Men för att övervaka lokalisering i mer förfinade strukturer, till exempel, kloroplasten höljet, är det lämpligt att visualisera fluorescensen i protoplaster isolerade från transformerade tobaksblad. En uppsättning BiFC vektorer innehållande antingen en C-terminal eller N-terminal fluorescerande tagg måste användas för BiFC tillvägagångssätt i växter ^10. Den nedan beskrivna protokollet användes för att studera växelverkan mellan cytosoliskt värmechockprotein 90 (HSP90) med tetratricopeptide repeat (RTB) domän som innehåller dockning proteiner Toc64 och AtTPR7 bor i kloroplasten yttre kuvertet och det endoplasmatiska nätverket, respektive ^11-13. För detta ändamål var HSP90 fuserad till CtPlint del av SCFP (SCFP ^C). Taggen var N-terminalt sammansmält med kaperon för att säkerställa tillgängligheten av den C-terminala MEEVD bindande motivet av HSP90 till klämtyp TPR domäner. Parallellt var den N-terminala delen av Venus (Venus ^N) sammansmält med de cytosoliska domänerna av TPR domän innehållande dockning proteiner Toc64 och AtTPR7, respektive. Som en negativ kontroll vi klonat den lösliga C-terminala delen av SCFP ^C enbart som bor i cytosolen och är därför en lämplig kontroll.

De fluorescerande taggarna i de studerade proteinerna måste möta samma cellulära utrymmet för att tillåta närhet och därmed beredning av fluorescerande signal. För att bestämma lokaliseringen av den rekonstituerade fluorescerande signal ett markörprotein sammansmält med en annan fluorescens tagg kan samtransformeras för att demonstrera den subcellulära lokaliseringen av interaktionen. En ER markörprotein fuserat till mCherrry förvandlades samtidigt ifallet av ER belägen AtTPR7 ^14. Den autofluorescens av klorofyll gjorde som kloroplast markör vid Toc64. Genom att detta inte bara interaktionen av Toc64 och AtTPR7, respektive, med den cytosoliska HSP90 chaperone in vivo kan övervakas direkt i tobaksbladen, utan också av den subcellulära lokaliseringen av samverkan kan undersökas.

BiFC är väl lämpad som ett komplement till andra metoder som studerar protein-proteininteraktioner. Jämfört med coimmunoprecipitation eller i rullgardins vitro experiment, till exempel, finns det inga specifika antikroppar måste finnas tillgängliga för proteinerna av intresse, och proteinerna måste inte uttryckas rekombinant in vitro, vilket kan vara en utmaning, särskilt för membranproteiner. Dessutom även transienta interaktioner kan övervakas med hjälp BiFC, eftersom proteinerna fångas genom interaktionen av de fuserade fluorescerande taggar ^15.

Protocol

1. Transformation av BiFC Konstrukt i Agrobacteria Kloning av BiFC konstruktioner Amplifiera genen av intresse från en lämplig mall med användning av oligonukleotider som innehåller flankerande attB-ställen. Utför en PCR med hjälp av en korrekturläsning polymeras. Adapt längden av härdningssteget med konstruktions primerkombination och längden av förlängningssteg enligt den fragmentstorlek. Kontrollera den PCR-produkt genom agarosgelelektrofores och rena den genom att använda ett PCR Cl…

Representative Results

I detta exempel använde vi BiFC metod för att följa interaktionen av den cytosoliska molekylär chaperon HSP90 med membrandockningsproteiner AtTPR7 och Toc64. AtTPR7 är en del av Sec translocon och interagerar med cytosoliska chaperoner, som eventuellt levererar sekretoriska preproteins för posttranslationell translokation till ER-membranet. Likaså Toc64 på kloroplasten ytterkuvertet agerar i post-translationell import genom att ta emot HSP90 tillhörande kloroplast preproteins. Båda proteiner innefattar ett cyt…

Discussion

Vid planeringen av en BiFC experiment flera punkter bör beaktas. Även om ingen strukturell information om de proteiner av intresse krävs, har topologin att vara känd när man arbetar med membranöverbryggande proteiner. De fluorescerande proteinerna måste bo i samma subcellulära fack eller står inför samma sida av ett membran för att möjliggöra samverkan. Naturligtvis, när analysera proteiner som kräver en N-terminal målsökningssekvensen, endast en C-terminal tag kan övervägas. Eftersom det är möjligt…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)