Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

Høje niveauer af reaktive ilt arter (ROS) kan medføre en ændring i cellulær redox tilstand mod oxidativt stress tilstand. Denne situation medfører oxidation af molekyler (lipid, DNA, protein) og fører til celledød. Oxidativt stress påvirker også udviklingen af ​​en række patologiske tilstande som diabetes, retinopathier, neurodegeneration og kræft. Derfor er det vigtigt at definere redskaber til at undersøge oxidative stress betingelser ikke kun på niveauet af enkelte celler, men også i forbindelse med hele organismer. Her mener vi, at zebrafisk foster som en nyttig in vivo system til at udføre sådanne undersøgelser og præsentere en protokol til at måle in vivo oxidativ stress. Drage fordel af fluorescerende ROS sonder og zebrafisk transgene fluorescerende linjer, vi udvikler to forskellige metoder til at måle oxidativt stress in vivo: i) et "hel foster ROS-afsløring Method" til kvalitativ måling af oxidativt stress og ii) et "encellede ROS afsløring metode "for kvantitative målinger af oxidativ stress. Heri, vi påvise effekten af ​​disse procedurer ved at øge oxidativt stress i væv ved oxidant agenter og fysiologiske eller genetiske metoder. Denne protokol er modtagelig for forward genetiske skærme, og det vil bidrage til at løse årsagssammenhængen af ​​realkreditobligationer i dyremodeller af oxidative stress-relaterede sygdomme såsom neurologiske lidelser og kræft.

Introduction

Oxidativt stress er specifikt defineret som en tilstand, der skyldes en ubalanceret cellulær redox tilstand. De komplekse redox reaktioner, der rutinemæssigt opstår inde i cellerne bestemme den cellulære redox-tilstand. Redoxreaktioner består af alle kemiske reaktioner, der består i overførsel af elektroner mellem atomer af biologiske molekyler, der producerer reduktion og oxidation af molekyler (dvs. redox reaktioner). Disse reaktioner katalyseres af elektronisk aktiverede arter (dvs. pro-oxidative arter), der er karakteriseret ved en ekstrem strukturel ustabilitet og spontan aktivering af ubalancerede elektroner, der udveksler med nabolandene biomolekyler. Disse uregelmæssige reaktioner resultere i DNA-skader, protein carboxylering og lipid oxidation, og i sidste ende føre til celledød ^1. Øgede niveauer af oxidativ stress har været forbundet med aldring og progression af forskellige patologiske tilstande ^2. Oxidativ stress harblevet rapporteret til at være ansvarlig for vaskulære ændringer i diabetes og hjerte-kar-sygdomme ^3,4. Det spiller også en afgørende rolle i neuronal degeneration i Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom ^5.. Desuden har oxidativt stress blevet påvist som en kritisk faktor i styrende kræft progression og metastatiske begivenheder ^6,7. Desuden kan inflammation og immunresponser fremkalde og yderligere støtte oxidativt stress ^8.

I levende celler, der pro-oxidative arter stammer fra ilt (ROS, reaktive ilt arter) eller kvælstof (RNS, reaktive nitrogen arter). ROS indbefatter hydroxyl-radikal, superoxid anion ^(OH). (O ₂ ^-) og hydrogenperoxid _{(H2O 2).} Den primære RNS er lattergas ^(NO).. En række sekundære reaktive arter kan genereres ved spontane interaktioner between ROS og RNS eller frie metalioner ^9. For eksempel superoxidanionen reagerer med nitrogenoxid for at danne peroxynitrate (ONOO ^-), mens H ₂ O ₂ reagerer med ^{Fe2 +} genererer hydroxylradikaler. ROS og RNS på grund af deres evne til at reagere med flere biomolekyler, betragtes en farlig trussel for opretholdelse af den fysiologiske redoxtilstand ^10. For at opretholde redoxtilstanden celler er udstyret med en række afgiftende antioxidant molekyler og enzymer. Superoxid dismutase (SOD), katalase, glutathion-peroxidase og Peroxiredoxins væsentlige udgør antioxidanten enzymatisk-arsenal, der giver cellulære beskyttelse mod pro-oxidative arter herunder H ₂ O _2, OH og Oono ^{-. 11..} Også anti-oxidant molekyler som vitamin C og E, polyphenoler og CoenzymeQ10 (CoQ10) er af afgørende betydning at slukke ROS og deres farlige dederivater ^12,13. Imidlertid er en overdreven produktion af ROS og RNS eller en dysfunktion i antioxidant-system, skifter cellulær redox-state mod oxidativ stress ^14.

Udover deres negative konnotationer, kan ROS spille forskellige fysiologiske roller i celler af forskellig oprindelse. Celler producerer normalt ROS som signalmolekyler at mægle normale biologiske begivenheder såsom vært forsvar og sår reparation ^15-17. Reaktive arter produceres normalt i celler ved intracellulære enzymer, såsom NOX (NADPH oxidase) og XO (Xantine Oxidase) som reaktion på signalering faktorer, vækstfaktorer og intracellulære udsving i calciumniveauer ^18,19. Det er blevet rapporteret, at ROS differentielt kan modulere aktiviteten af vigtige nukleare faktorer, såsom p53 eller cellulære bestanddele, såsom ATM-kinase, en master regulator af respons på DNA-skade ^20. Analogt ROS stor indflydelse cellulær signalering ved at formidle the oxidation og inaktivering af protein tyrosinphosphataser (PTP'er), der er etableret som kritiske regulatorer af signaltransduktion ^21. Desuden proteom baserede metoder viser, at RNS også er ansvarlige for specifikke protein modifikationer og ændringer af molekylære signalering. RNS reagerer med cystein thiolgrupperne ændre dem i S-nitrothiols (SNO) og udløser molekylære veje samtidig med patologiske tilstande såsom inflammatoriske og autoimmune sygdomme ^22,23.

Da celledyrkningsforsøg kun delvist gengive de mange faktorer, der handler in vivo, er det af stor interesse for at udføre redox studier i dyremodeller ^24,25. For at opnå dette, har zebrafisk blevet betragtet som en passende hvirveldyr model til at studere oxidative stress dynamik ^26. Zebrafisken er en ny model system, der giver flere fordele til at studere cellulære og genetiske begivenheder i hvirveldyr development og sygdom. Store klynger af embryoer kan genereres og ugenligt til forsøg behov. Desuden den ekstraordinære optisk klarhed af zebrafisk embryoner, samt deres lille størrelse, giver enkelt celle billedbehandling og dynamisk tracking i en hel organismer ^27. I det sidste årti, har et betydeligt antal zebrafisk mutanter blevet genereret til at modellere humane patologiske tilstande som kræft og genetiske sygdomme ^28-31. Vigtigst er det, har et væld af transgene linier blevet produceret til at tillade omfattende muligheder af genetiske og biologiske manipulationer ^32. For eksempel er transgene vævsspecifikke zebrafisk linjer regelmæssigt anvendes til in vivo-undersøgelser. Disse linjer udtrykker et fluorescerende protein under kontrol af en udvalgt promotor, som giver mulighed for at identificere enkelte celler in vivo, såvel som den anatomiske struktur, de omfatter.

Adskillige toksikologiske undersøgelser har allerede brugt than-zebrafisk at vurdere in vivo-virkningen af kemikalier på redox homeostase, hvilket antyder egnetheden af denne hvirveldyr som en dyremodel for området for lægemiddelforskning og oxidativt stress ^33-35. Selvom nogle fluorescerende prober er blevet testet til at overvåge oxidativt stress i zebrafisk larver ^36,37, er der ingen etablerede assays at påvise og måle niveauet af oxidativt stress i zebrafisk væv og levende celler. Her beskriver vi en procedure for in vivo kvantificering af oxidativt stress i levende celler i zebrafisk embryoner. Billedbehandling værktøjer, FACS sortering, fluorescerende prober og pro-oxidative betingelser er alle sammen til at generere en simpel analyse til påvisning og kvantificering af oxidative arter i zebrafisk embryoner og væv.

Protocol

1.. Udarbejdelse af instrumenter og Arbejdsvilkårene Solutions Forbered fiskevand løsning. Lav en stamopløsning ved at opløse 2 g havsalt 'Instant Ocean' i 50 ml destilleret vand. Tilføj 1,5 ml af stock fisk vand til 1 L destilleret vand til fremstilling af klar til brug fisk vand (60 ug / ml havet salte slutkoncentration). Autoklaver den klar til brug fisk vand før brug. Denne opløsning anvendes som zebrafisk embryo medium. Forbered methylcellulose for embryo montering. 1,5 g methylc…

Representative Results

Ved at anvende den metode, der er beskrevet her, kan vi nemt måle og registrere oxidativt stress (og ROS-niveauet) i zebrafisk embryonale væv. Efter at have krydset voksen zebrafisk bliver æg opsamles og får lov at udvikle sig ved 28 ° C til 72 timer efter befrugtning (HPF). For at fremkalde oxidativ stress, foreslår vi to forskellige tilgange: 1) behandling af fostre med stærke pro-oxidant reagenser eller 2) at fremme ROS dannelse efter vævsskade. I den første metode, vi ansat to f…

Discussion

Kritiske trin

Proceduren for oxidativt stress detektion i zebrafisk embryoner beskrevet heri omfatter to forskellige metoder. Hele mount ROS-påvisningsmetode er primært en kvalitativ analyse for ROS-detektion, mens enkelt celle ROS-detektionsmetode giver mere specifikke kvantitative målinger (figur 1). Begge metoder giver en hurtig og nem måde at vurdere in vivo ROS-afsløring på zebrafisk embryoner. Men de begge præsentere nogle kritiske trin.

<p class="jov…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Hydrogen peroxide solution	SIGMA	516813	DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X	GIBCO	14025
Methyl cellulose	SIGMA	M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture	INSTANT OCEAN	SS15-10
Tricaine	SIGMA	A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine	INVITROGEN	D23107
Rotenone	SIGMA	R8875	Prepare 5mM stock solution in DMSO.
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine	EnzoLifeScience	BML-EI395	dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide	Molecular probes       (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	Molecular probes         (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3'	Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P	ROCHE	11213857001	Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO	10010-056
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	ROCHE		Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red	GIBCO	15400-054	Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope	ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination	Nikon	AZ100
camera	ZEISS	AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition	ZEISS	ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter	BD FACSCalibur
Centrifuge	Eppendorf	5417R
FACS tubes	BD	342065
Multiwell Plate	BD Falcon	353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm	VWR	391-1915
Confocal microscope	Leica	Leica SP5