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Biologia

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

Published: July 07, 2014
doi:
10.3791/51328
, ,
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science,University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology,Vesalius Research Center, VIB

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

活性酸素種（ROS）高レベルの酸化ストレス状態に向かって細胞の酸化還元状態の変化を引き起こすことがある。この状況は、分子（脂質、DNA、蛋白質）の酸化を引き起こし、細胞死に至る。酸化ストレスにも影響、糖尿病、網膜症、神経変性、および癌などのいくつかの病理学的状態の進行。これにより、単一細胞のレベルではなく、生物全体との関連においてのみならず、酸化ストレス状態を調査するためのツールを定義することが重要である。ここでは、そのような研究を行い、in vivoでの酸化ストレスを測定するためのプロトコルを提供するように、インビボ系において有用であるとゼブラフィッシュ胚を考える。 "i）の酸化ストレスの定性的測定のための「全胚ROS検出法」およびii）A：蛍光ROSプローブ及びゼブラフィッシュトランスジェニック蛍光線を利用して、我々は、 生体内で酸化ストレスを測定するための2つの異なる方法を開発単一細胞ROS酸化ストレスの定量的測定のための検出方法 "。ここで、我々は、酸化剤および生理学的または遺伝的方法によって、組織における酸化ストレスを増加させることによって、これらの手順の有効性を実証する。このプロトコルは、フォワード遺伝子スクリーニングのために適している、それはそのような神経疾患や癌などの酸化ストレスに関連する病状の動物モデルにおけるROSのアドレス因果関係を支援します。

Introduction

酸化ストレスは、特にアンバランス細胞のレドックス状態から生じる状態と定義される。日常の内側の細胞を発生する複雑な酸化還元反応は、細胞の酸化還元状態を決定する。酸化還元反応は、分子の還元および酸化を生産する生物学的分子の原子間の電子の移動で構成され、全ての化学反応（ すなわち酸化還元反応）で構成されています。これらの反応は極端な構造的な不安定性や近隣の生体分子と交換するアンバランスな電子の自然活性化を特徴としている電子的に活性種（ すなわち酸化促進種）によって触媒される。これらの不規則な反応は、DNA損傷、タンパク質カルボキシル化、および脂質酸化にもたらし、最終的に細胞死をもたらす1。酸化ストレスのレベルの増加は、加齢と異なる病態2の進行と関連している。酸化ストレスはあります糖尿病や心血管疾患3,4の血管の変化の原因であることが報告されて。それはまた、アルツハイマー病における神経変性に重要な役割を果たしており、パーキンソン病5。さらに、酸化ストレスは、癌の進行および転移性事象6,7を支配する重要な要因として実証されている。加えて、炎症および免疫応答を惹起し、さらに酸化ストレス8をサポートすることができる。

または窒素（RNS、反応性窒素種）、生きた細胞において、酸化促進種は、酸素（活性酸素種ROS）に由来する。 （OH）（O 2 – ）、過酸化水素（H 2 O 2）ROSは、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオンが挙げられる。主なRNSは亜酸化窒素（NO）である。二次反応種の一連のbetwee自発的相互作用によって生成することができるROS及びRNSまたはフリーの金属イオンが9 N。 H 2 O 2は、Fe 2 +、ヒドロキシルラジカルを生成すると反応しながら、 –例えば、スーパーオキシドアニオンはperoxynitrate（ONOO）を形成する亜酸化窒素と反応する。いくつかの生体分子と反応する能力のために、ROS及びRNSは、生理的な酸化還元状態10を維持するために危険な脅威と考えられている。酸化還元状態の細胞を維持するために抗酸化分子や酵素を解毒する一連のを完備しています。 11 –スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）は、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびペルオキシレドキシンは、本質的にH 2 O 2、OH及びOONO含む酸化促進種からの細胞の保護を提供する抗酸化酵素-武器を構成する。また、ビタミンCおよびE、ポリフェノールおよびコエンザイムQ10（コエンザイムQ10）のような抗酸化分子がROSとその危険な脱をクエンチする非常に重要である12,13 rivatives。しかし、ROS及びRNSの過剰産生、または抗酸化系における機能不全は、酸化ストレス14に向かって細胞の酸化還元状態に移行する。

彼らの否定的な意味合いのほかに、ROSは、異なる起源の細胞では、様々な生理的役割を再生することができます。細胞は通常、宿主防御および創傷修復の15〜17などの通常の生物学的事象を仲介するシグナル伝達分子として、ROSを生成する。反応種は、通常、シグナル伝達因子、成長因子、およびカルシウムレベル18,19の細胞内変動に応答してそのようなNOX（NADPHオキシダーゼ）およびXO（キサンチンオキシダーゼ）のような細胞内酵素により細胞内で産生される。これは、ROSを差動例えばATM-キナーゼなどのp53または細胞成分、DNA損傷に応答し20のマスター調節因子として重要な核因子の活性を調節し得ることが報告されている。同様にROSは強く目を媒介することによって細胞内シグナル伝達に影響を与える電子酸化及びシグナル伝達21の重要な調節因子として確立されているタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）の不活性化。また、プロテオミクスベースの方法論は、RNSは、分子シグナリングの特定のタンパク質の修正および変更に責任があることを示している。 RNSは、S-nitrothiols（SNO）にそれらを変更し、このような炎症性疾患および自己免疫疾患などの病理学的状態22,23に付随する分子経路を誘発システインチオール基と反応する。

細胞培養実験は、部分的にのみインビボで作用する多数の因子を再現するので、動物モデル24,25レドックス研究を行うために非常に興味深い。これを達成するために、ゼブラフィッシュは、酸化ストレスのダイナミクス26を研究するために適切な脊椎動物動物モデルと考えられてきた。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のDEV間、細胞および遺伝的事象を研究するいくつかの利点を付与する新たなモデル系であるelopmentと病気。胚の大きなクラスターが生成され、実験的なニーズのために毎週利用可能することができる。また、ゼブラフィッシュ胚の異常な光学的透明性だけでなく、その小さなサイズは、全生物27の単一細胞イメージングと動的トラッキングを可能にします。過去10年間では、ゼブラフィッシュ変異体の相当数は、癌や遺伝病28〜31のようなヒトの病的状態をモデル化するために生成されました。最も重要なことには、多数のトランスジェニック系統は、遺伝的および生物学的操作32の大規模な機会を可能にするように製造されている。例えば、トランスジェニック組織特異的なゼブラフィッシュ系統を定期的にin vivo研究のために利用される。これらの線は、インビボで単一細胞を同定する能力、ならびにそれらが含む解剖学的構造を提供する、選択されたプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現する。

いくつかの毒物学的研究は、すでにTを使用していた彼は、創薬および酸化ストレス33-35のフィールドのための動物モデルとして、この脊椎動物の適合性を示唆し、酸化還元ホメオスタシスに対する化学物質のインビボ効果を評価するためにゼブラフィッシュ。いくつかの蛍光プローブは、ゼブラフィッシュの幼虫36,37における酸化ストレスを監視するために試験されているにもかかわらず、ゼブラフィッシュ組織および生体細胞内の酸化的ストレスのレベルを検出および測定するための確立されたアッセイは存在しない。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の生細胞における酸化ストレスのin vivo定量化のための手順を記述している。イメージングツール、FACSソーティング、蛍光プローブおよび酸化促進条件が全てゼブラフィッシュ胚および組織中の酸化種の検出および定量のための単純な検定を生成するために組み合わされる。

Protocol

1。楽器の準備と作業溶液魚の水溶液を調製する。蒸留水50ml中の海塩「インスタントオーシャン」の2グラムを溶解することにより保存溶液を作る。 （最終濃度60μg/ mlの海の塩）魚の水を使用する準備ができて準備する1リットルの蒸留水に株式魚の水の1.5ミリリットルを追加します。使用法の前に魚の水を使用する準備ができてオートクレーブ。この溶液を、ゼブラフィッシュ胚培地…

Representative Results

ここに記載された方法を適用することによって、我々は簡単にゼブラフィッシュ胚組織における酸化ストレス（ROS及びレベル）を測定し、検出することができる。大人のゼブラフィッシュを横断した後、卵を回収し、72時間後に受精（HPF）に28℃で開発することが許可されています。強い酸化促進試薬との胚の1）の処置または2）組織損傷後のROS形成を促進する酸化的ストレスを誘導するため?…

Discussion

重要なステップ

本明細書に記載されるゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを検出するための手順は、2つの異なる方法を含む。単一細胞ROS検出方法（ 図1）のより具体的な定量的測定を可能にしながら、ホールマウントROS検出方法は、主にROS検出のための定性的なアッセイである。どちらの方法も、ゼブラフィッシュ胚に、生体内のROS検出を評価す…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes       (Life Technologies)  P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes         (Life Technologies)  A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
camera  ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5
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Referências

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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).
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